Клинико-генетические особенности при полной и частичной врожденной аниридии | Суханова Н.В., Кадышев В.В., Васильева Т.А., Марахонов А.В., Катаргина Л.А., Куцев С.И., Зинченко Р.А.

Введение

Врожденная аниридия (OMIM #106210) (ВА) — это редкая врожденная наследственная патология глаза. ВА наследуется по аутосомно-доминантному типу. Более половины случаев ВА спорадические, без отягощенной семейной истории. Частота ВА составляет, по данным разных авторов, 1 случай на 40 000–96 000 человек [1, 2]. ВА в большинстве (85%) случаев наблюдается как самостоятельный порок развития глаза, в 13% случаев является составной частью клинической картины синдрома WAGR (Wilms tumor — опухоль Вильмса, Aniridia — аниридия, Genitourinary anomalies — патологии мочеполовых органов) (OMIM #194072), в 2% может выявляться при других наследственных синдромах.

При ВА отмечается полное отсутствие или частичный дефект ткани радужной оболочки разной степени выраженности. Частичная или полная аниридия сочетается с гипоплазией фовеальной зоны и диска зрительного нерва, а также сопровождается светобоязнью, нистагмом и значительным снижением зрительных функций. Часто при аниридии наблюдается сопутствующая окулярная патология, включая катаракту, вторичную глаукому, помутнение и васкуляризацию роговицы, которые могут развиваться с рождения или в первую декаду жизни с постепенным прогрессированием [3].

Синдром WAGR включает сочетание аниридии с опухолью Вильмса, аномалиями мочеполовой системы и умственной отсталостью [4].

Врожденная аниридия обусловлена внутригенными мутациями гена PAX6 или хромосомными перестройками, задевающими локус 11p13. При синдроме WAGR наблюдаются хромосомные перестройки региона 11р13, захватывающие, по крайней мере, два локуса генов PAX6 и WT1.

Основной механизм действия мутаций при ВА — это гаплонедостаточность функции гена PAX6, возникающая из-за инактивации одного аллеля гена вследствие наличия мутации. Несмотря на это, экспрессивность одинаковых мутаций и, как следствие, клиническая картина у отдельных пациентов может быть очень разной даже в пределах одной семьи.

Описание глазного фенотипа у пациентов с ВА из-за множественности поражений почти всех структур глаза представляет собой важную и еще не решенную задачу.

Целью исследования явилось изучение клинико-генетических корреляций между особенностями клинических проявлений ВА и мутациями разного типа в гене PAX6 (включая хромосомные делеции, удаляющие часть или весь ген).

Материал и методы

В исследование включили 83 пациента из 76 неродственных семей с клиническими признаками ВА, в том числе 46 (55,4%) мужчин и 37 (44,6%) женщин. Возраст пациентов варьировал от 0 до 46 лет (69 (83,13%) пациентов были младше 16 лет), в среднем 11,5±10,3 года.

Все пациенты или их законные представители подписали письменное информированное согласие на проведение обследования. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ «МГНЦ».

За период 2017–2019 гг. было проведено комплексное офтальмологическое и молекулярно-генетическое обследование, из них под наблюдением в динамике находились 59 (71,08%) человек.

Основным критерием включения являлась ВА.

Критерием невключения являлось отсутствие мутации в гене РАХ6.

Обследование пациентов проводили в НИИ педиатрии ЦКБ РАН, ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России, ФГБНУ «МГНЦ» по протоколу офтальмологического и молекулярно-генетического обследования.

При соматическом осмотре пациентов выделяли признаки дисморфогенеза для исключения случаев сопутствующей синдромальной патологии в составе аниридии. Всем больным выполняли полное офтальмологическое обследование, которое включало визометрию, авторефкератометрию. Рефракцию у детей грудного, раннего и дошкольного возраста исследовали с помощью метода скиаскопии. Для оценки внутриглазного давления использовали тонометрию. По данным биомикроскопии документировали морфологические изменения переднего отрезка, изменение роговицы, хрусталика и стекловидного тела и степень отсутствия радужной оболочки. Офтальмоскопию выполняли с использованием широкоугольной бесконтактной асферической линзы.

Диагноз ВА подтверждали в ФГБНУ «МГНЦ», где проводили офтальмологическое обследование, молекулярно-генетическое изучение и медико-генетическое консультирование.

Выделение ДНК из жидкой периферической крови пациентов проводили с использованием набора Wizard^® Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для поиска генетической причины ВА проводился анализ малых мутаций в гене PAX6 методом секвенирования по Сэнгеру нуклеотидной последовательности 13 экзонов и прилегающих интронных областей (выполнено для экзонов с 3 по 13 транскрипционной изоформы NM_000280.4 и экзон 5а изоформы NM_001604.5, расположенного внутри интрона 5 главной изоформы) и анализ числа копий генов в хромоcомной области 11p13 методом мультиплексной реакции лигазозависимой амплификации проб (MLPA). Далее, в случаях выявления хромосомной делеции, затрагивающей ген WT1, для подтверждения результатов MLPA проведена таргетная флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с локус-специфичным ДНК-зондом на ген WT1. MLPA анализ проводился с использованием in situ гибридизация набора проб P219-B2 PAX6 (SALSA^® MLPA^® MRC-Holland, Голландия) в соответствии с рекомендациями производителя [5].

Для проведения FISH использовался набор FA0275 (Abnova, Taiwan). In situ гибридизация (интерфазная FISH) выполнена на препаратах, приготовленных из суспензии фиксированных некультивированных лимфоцитов периферической крови пациентов. Статус патогенности выявленных вариантов нуклеотидной последовательности устанавливался на основе рекомендаций Американской коллегии медицинской генетики, геномики и ассоциации молекулярной патологии [6].

Функциональное in vitro исследование последствий вариантов нуклеотидной последовательности в интронах проведено в лаборатории функциональной геномики ФГБНУ «МГНЦ» по оригинальной методике [7].

Анализ гено-фенотипических корреляций, а также соотношений признаков ВА в зависимости от типа повреждения радужки проводился с использованием критерия Фишера путем построения таблиц сопряженности 2×2. Достоверным считался уровень значимости р<0,05.

Результаты исследования

Полная ВА (ПВА) наблюдалась у 46 (55,4%) пациентов. У 37 (44,6%) пациентов отмечена частичная ВА (ЧВА) с асимметричным сохранением рудиментарных остатков радужки, в том числе включая глаза с колобоматозными дефектами и участками секторальной гипоплазии.

Среди 83 исследованных пациентов из 76 семей для 16 (19,28%) установлена отягощенная семейная история ВА, спорадические случаи аниридии выявлены у 67 (80,72%) пациентов.

У 9 (10,8%) пациентов ВА подтвержден синдром WAGR. При синдроме WAGR ВА сопровождалась другими соматическими поражениями, которые включали: крипторхизм, гипоспадию, аномалии развития влагалища, матки, умственную отсталость с сопутствующими нейро-, психомоторными и речевыми задержками.

В таблице 1 представлены данные о патологии глаза при врожденной аниридии с учетом деления на 2 группы — ПВА и ЧВА.

Как показано в таблице 1, наиболее частым симптомом, встречающимся у всех пациентов как при ПВА, так и при ЧВА, являлась гипоплазия фовеа. Офтальмоскопические признаки фовеальной гипоплазии характеризовались отсутствием фовеальной депрессии, неровностью пигментации макулярной области.

У 81 (97,5%) пациентов с ВА выявлен оптический нистагм, в 81 (97,5%) случае присутствовал горизонтальный компонент, у 3 (3,6%) диагностирован ротаторный компонент.

Острота зрения при оптическом нистагме была низкой и колебалась от 0,06 до 0,3. Средняя величина остроты зрения без оптической коррекции составила 0,15, после адекватной коррекции — 0,2.

Изменения в хрусталике были зарегистрированы у 67 (80,7%) пациентов с ВА и во всех случаях имели двусторонний характер. Изменения в хрусталике проявлялись в виде врожденных катаракт (капсуло-лентикулярная — 23 (34,3%), заднекапсулярная — 3 (4,5%), лентикулярная — 14 (20,9%), центральная — 11 (16,4%) и атипичная — 9 (13,4%)) и приобретенных катаракт (7 (8,5%)), к которым относились пылевидная и полная осложненная. При синдроме WAGR изменения в хрусталике диагностированы в 7 (77,8%) случаях от общего количества пациентов с данным синдромом.

Изменения, обнаруженные в ДЗН, также носили различный характер, их частота существенно не различалась при ПВА и ЧВА. Патологические глаукомные изменения ДЗН выявлены в 12 (14,5%) случаях.

Нарушение функции глазодвигательных мышц выявлено у 49 (59,04%) пациентов и имело различный характер: в 37 (44,6%) случаях — альтернирующее сходящееся косоглазие, в 10 (12,05%) — альтернирующее расходящееся косоглазие, в 2 (2,41%) случаях диагностировано паретическое сходящееся косоглазие.

Аниридийная кератопатия (АК) развивалась у 41 (49,4%) пациента, при ПВА АК отмечалась статистически значимо чаще, чем при ЧВА (p=1,3×10^–5).

Сроки манифестации глаукомы определялись различной степенью выраженности гониодисгенеза. Аномалия угла передней камеры (УПК) выявлена у 79 (95,2%) пациентов. У 3 (3,61%) пациентов из 83 УПК не осмотрен из-за высокой амплитуды нистагма. В 1 (1,2%) случае УПК был открыт. При ЧВА аномалия УПК диагностирована у 33 (89,1%) человек (74 глаза), при ПВА — у всех 46 (100%). Различий в рассматриваемых группах не выявлено.

Степень аметропии удалось определить у 76 (91,6%) пациентов, у остальных 7 (8,4%) пациентов (3 (6,5%) с ПВА и 4 (10,8%) с ЧВА) рефрактокератометрия оказалась невозможна в связи с помутнением оптических сред из-за выраженной АК и помутнений хрусталика. В 46 (56,6%) случаях аномалии рефракции сочетались с астигматизмом. При частичной аниридии в разных возрастных группах выявлено 22 (59,4%) случая с астигматизмом. У пациентов с ЧВА наблюдалась тенденция к увеличению угла косоглазия при повышении степени аномалии рефракции, однако прямой взаимосвязи выявлено не было. У 76 (91,6%) из 83 пациентов обнаружены отклонения рефракции от эмметропии и возрастной нормы. Данные представлены на рисунке.

При молекулярно-генетическом исследовании диагноз был подтвержден в 100% случаев. Методом секвенирования по Сэнгеру обнаружены 53 различных внутригенных патогенных варианта нуклеотидной последовательности гена PAX6 в гетерозиготном состоянии. Варианты расположены в разных экзонах гена PAX6 и фланкирующих их участках интронов. 42 варианта обнаружены в кодирующей части гена, 1 — в 5′-НТО (5′-нетранслируемой области гена) и 10 — в интронах. Методом MLPA выявлены 22 разные хромосомные делеции размером от 0,5 тыс. до 7,4 млн п. о. Обширные хромосомные делеции обнаружены у 13 пробандов с ВА (16 пациентов) и 9 пациентов (9 пробандов) с синдромом WAGR. Среди пробандов с ВА и выявленными делециями — 10 (80%) спорадических случаев и 3 (20%) семейных (6 пациентов). Все 9 случаев синдрома WAGR — спорадические.

Идентифицированные у пациентов с ВА патогенные варианты гена PAX6 и соотношение выявленных мутаций различных типов представлены в таблице 2.

У 44 пробандов ((83,0%), 44 из 53 гетерозиготных носителей патогенных вариантов последовательности гена PAX6) обнаружены варианты последовательности, приводящие к потере функции (LOF — loss-of-function). Среди них 18 нонсенс-замен, 15 вариантов, приводящих к сдвигу открытой рамки считывания, 10 вариантов, нарушающих сплайсинг (5 вариантов, нарушающих сайты сплайсинга, и 5 интронных вариантов) и 1 изменение сайта инициации трансляции.

При анализе клинико-генетических корреляций (табл. 3) было показано, что у пациентов с мутациями сайтов сплайсинга статистически значимо более часто встречается ЧВА, чем при других видах мутаций. В группе пациентов с нонсенс-мутациями чаще встречались гипоплазия зрительного нерва, сходящееся косоглазие, аниридийная кератопатия в сочетании с недостаточностью лимбальных стволовых клеток (НЛСК). У большинства пациентов с делецией 3′-цис-регуляторного региона отмечено более частое развитие вторичной глаукомы.

Обсуждение

Частичное или полное отсутствие радужной оболочки возникает вследствие нарушения дифференцировки эпителиальных клеток периферической части глазного бокала и миграции клеток периокулярной мезенхимы, формирующих строму радужки [8]. При ВА поражаются различные структуры глаза — это результат врожденного порока развития и следствие последующих осложнений.

Аниридийная кератопатия обусловлена недостаточностью НЛСК, аномальным ответом на повреждения: сниженной экспрессией металлопротеиназы 9 (желатиназы B), миграцией эпителиальных клеток роговицы [9] и недостаточным подавлением неоангиогенеза [10]. Собственные исследования показали, что АК развивалась у 41 (49,4%) пациента, однако субклинические изменения роговицы встречаются у 90% людей с ВА [11].

Анализ рефракции и косоглазия показал существенные отклонения рефракции от возрастной нормы, а нарушение функции глазодвигательных мышц имело различный характер. Это согласуется с мнением других ученых, которые также отмечают нарушения рефракции (миопия, гиперметропия, астигматизм) [3], что может приводить к развитию косоглазия (по данным L.B. Nelson et al. [12], наиболее частым видом стробизма при данном заболевании является эзотропия) и амблиопии.

Развитие глаукомы в раннем детстве связано с дисгенезом УПК глаза и аплазией Шлеммова канала [1]; в более позднем возрасте — с обструкцией трабекулярной сети и закрытием УПК глаза вследствие формирования спаек между стромой радужки и периферической частью роговицы [13]. Проведенное нами исследование подтвердило данное мнение.

Мутации в гене PAX6 приводят к ВА [3]. По данным N.G. Hall et al. [14], мутации в гене PAX6 или его делеции объясняют до 90% случаев этого заболевания.

Около 96% всех описанных мутаций являются внутригенными. Самым частым типом внутригенных мутаций PAX6 являются нонсенс-мутации (около 39%), реже встречается сдвиг рамки считывания (27%), мутации сайтов сплайсинга (15%), миссенс-мутации (12%). Остальные 4% мутаций составляют делеции всего гена и мутации в 5′- и 3′-регуляторных областях [15]. Нами было показано, что в группе пациентов с мутациями сплайсинга более часто наблюдается частичная аниридия. В группе с нонсенс-мутациями статистически значимо чаще встречаются такие изменения, как гипоплазия зрительного нерва, сходящееся косоглазие, АК в сочетании с НЛСК. А в группе с делециями 3′-цис-регуляторного региона статистически значимо чаще выявляется вторичная глаукома.

Заключение

Изучение клинико-генетических корреляций проявлений врожденной аниридии и мутаций разного типа в гене PAX6, включая внутригенные и обширные делеции, имеет большое значение в диагностике и ведении пациентов. Наиболее частыми признаками, сопутствующими ВА, являются нистагм, катаракта, гипоплазия фовеа, НЛСК, аномалии рефракции, которые встречались в 60% случаев. При анализе гено-фенотипических корреляций удалось обнаружить статистические закономерности, которые могут указывать на взаимосвязь между клиническими признаками ВА и типом мутационных изменений. Таким образом, прогрессирующий характер течения ВА и связанной с ней сопутствующей патологии требует от врачей-офтальмологов первичного звена постоянного медикаментозного и хирургического сопровождения из-за неизменно присутствующей угрозы развития ассоциированной с аниридией кератопатии, глаукомы, а в случае хирургических вмешательств — еще и фиброзного синдрома.

Сведения об авторах:

Суханова Нателла Вахтанговна — врач-офтальмолог Научно-клинического центра генетики глазных болезней, научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ»; 115522, Россия, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1; ORCID iD 0000-0003-4371-775X.

Кадышев Виталий Викторович — к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии, врач-генетик, врач-офтальмолог Научно-клинического центра генетики глазных болезней ФГБНУ «МГНЦ», заведующий кафедрой офтальмогенетики ИВиДПО ФГБНУ «МГНЦ»; 115522, Россия, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1; ORCID iD 0000-0001-7765-3307.

Васильева Татьяна Алексеевна — к.б.н., старший научный сотрудник Лаборатории генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ»; 115522, Россия, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1; ORCID iD 0000-0002-6744-0567.

Марахонов Андрей Владимирович — к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ»; 115522, Россия, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1; ORCID iD 0000-0002-0972-5118.

Катаргина Людмила Анатольевна — д.м.н., профессор, заместитель директора по научной работе ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России; 105062, Россия, г. Москва, ул. Садовая-Черногрязская, д. 14/19; ORCID iD 0000-0002-4857-0374.

Куцев Сергей Иванович — д.м.н., академик РАН, директор ФГБНУ «МГНЦ», главный внештатный специалист по медицинской генетике Минздрава России; 115522, Россия, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1; ORCID iD 0000-0002-3133-8018.

Зинченко Рена Абульфазовна — д.м.н., член-корреспондент РАН, заместитель директора по научно-клинической работе, заведующая лабораторией генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ», заведующая кафедрой организации здравоохранения, общественного здоровья и медико-генетического мониторинга ИВиДПО ФГБНУ «МГНЦ»; 115522, Россия, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1; главный научный сотрудник отдела исследований общественного здоровья ФГБНУ «Национальный НИИ общественного здоровья имени Н.А. Семашко»; 105064, Россия, г. Москва, ул. Воронцово Поле, д. 12, стр. 1; ORCID iD 0000-0003-3586-3458.

Контактная информация: Суханова Нателла Вахтанговна, e-mail: natelasukhanova@gmail.com.

Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.

Конфликт интересов отсутствует.

Статья поступила 28.09.2022.

Поступила после рецензирования 20.10.2022.

Принята в печать 15.11.2022.

About the authors:

Natella V. Sukhanova — ophthalmologist of the Scientific and Clinical Center for Genetics of Eye Diseases, researcher of the Laboratory of Genetic Epidemiology, Research Center for Medical Genetics; 1, Moskvorechye str., Moscow, 115522, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-4371-775X.

Vitaly V. Kadyshev — C. Sc. (Med.), leading researcher of the Laboratory of Genetic Epidemiology; geneticist, ophthalmologist of the Scientific and Clinical Center for Genetics of Eye Diseases, Research Center for Medical Genetics; Head of the Department of Ophthalmic Genetics of the Institute of the Higher and Additional Professional Education, Research Center for Medical Genetics; 1, Moskvorechye str., Moscow, 115522, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-7765-3307.

Tatyana A. Vasilieva — C. Sc. (Biol.), senior researcher of the Laboratory of Genetic Epidemiology, Research Center for Medical Genetics; 1, Moskvorechye str., Moscow, 115522, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-6744-0567.

Andrey V. Marakhonov — C. Sc. (Biol.), leading researcher of the Laboratory of Genetic Epidemiology, Research Center for Medical Genetics; 1, Moskvorechye str., Moscow, 115522, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-0972-5118.

Lyudmila A. Katargina — Dr. Sc. (Med.), Professor, Deputy Director for Research, Helmholtz National Medical Research Center for Eye Diseases; 14/19, Sadovaya-Chernogryazskaya str., Moscow, 105062, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-4857-0374.

Sergey I. Kutsev — Dr. Sc. (Med.), Academician of the Russian Academy of Sciences, Director, Research Center for Medical Genetics; Chief External Expert of the Ministry of Health of the Russian Federation; 1, Moskvorechye str., Moscow, 115522, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-3133-8018.

Rena A. Zinchenko — Dr. Sc. (Med.), Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Deputy Director for Research and Clinical Activities, Head of the Laboratory of Genetic Epidemiology, Research Center for Medical Genetics; Head of the Department of Public Healthcare Organization, Public Health and Medical Genetic Monitoring of the Institute of the Higher and Additional Professional Education, Research Center for Medical Genetics; 1, Moskvorechye str., Moscow, 115522, Russian Federation; chief researcher of the Department of Public Health Studies, N.A. Semashko National Research Institute of Public Health; 12 build. 1, Vorontsovo Pole str., Moscow, 105064, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-3586-3458.

Contact information: Natella V. Sukhanova, e-mail: natelasukhanova@gmail.com.

Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned.

There is no conflict of interests.

Received 28.09.2022.

Revised 20.10.2022.

Accepted 15.11.2022.