Введение
Связь между нестабильностью генома соматических клеток и болезнями человека изучена очень слабо. Однако существует мнение, что различия в накоплении повреждений ДНК должны отражаться на вероятности возникновения некоторых заболеваний: чем больше повреждена ДНК, тем больше шансов у человека приобрести ту или иную морфофункциональную патологию [1].
Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ) — хроническое, часто рецидивирующее заболевание, ассоциированное с нарушением моторно-эвакуаторной функции желудка, которое характеризуется регулярно повторяющимся забросом желудочного и/или дуоденального содержимого в пищевод [2, 3]. Данные о распространенности ГЭРБ в России ограничены, а крупных метааналитических работ, систематизирующих результаты популяционных исследований, не проводилось [4]. Объективизация частоты ГЭРБ в российской популяции осложняется масштабами страны и мультиэтничностью населения. В ранних многоцентровых популяционных исследованиях частота регистрации ГЭРБ варьировала от 13,3 до 22,7% [4]. Распространенность ГЭРБ на территории Российской Федерации в настоящее время составляет от 11,3 до 23,6% [4, 5]. Высокие показатели заболеваемости связаны с множеством факторов: особенностями образа жизни и питания (нерегулярность, употребление большого количества полуфабрикатов или фастфуда), стрессом, наличием вредных привычек (курение, прием алкоголя), длительным, зачастую бесконтрольным приемом лекарственных средств (нестероидных противовоспалительных препаратов, глюкокортикостероидов, антибиотиков и др.), отсутствием своевременного обращения за медицинской помощью [6].
Вариабельность клинических проявлений достаточно широкая. К основным жалобам относятся изжога, боль за грудиной, диспептические расстройства. Наличие внепищеводных проявлений (сухой кашель, стоматит, осиплость голоса) затрудняет своевременную верификацию диагноза, что влечет за собой увеличение времени до назначения медикаментозной терапии [7]. Повреждение слизистой оболочки дистального отдела пищевода с развитием в нем дистрофических изменений неороговевающего многослойного плоского эпителия, катарального или эрозивно-язвенного эзофагита способствует увеличению частоты рецидивов заболевания, приводит к развитию цилиндроклеточной метаплазии и является фактором риска рака пищевода [3].
Основным методом диагностики ГЭРБ на амбулаторном этапе является фиброэзофагогастродуоденоскопия (ФЭГДС) — способ видеоэндоскопического анализа состояния слизистой оболочки пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, который позволяет точно визуализировать дефекты с последующим взятием биоптата для гистологического исследования [7]. ФЭГДС относится к инвазивным процедурам, имеет ряд противопоказаний и в редких случаях может приводить к повреждению или перфорации стенок органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Кроме того, для проведения обследования необходимо дорогостоящее оборудование и квалифицированные специалисты, что снижает его доступность. Поэтому актуальным является поиск маркеров ГЭРБ, которые позволят быстро, безопасно и дешево проводить скрининг и выделять группу риска для более глубокого обследования и наблюдения.
Одним из возможных маркеров тяжести течения ГЭРБ может быть количество повреждений митохондриальной ДНК (мтДНК). Обнаружено, что хроническое накопление низкоуровневых повреждений мтДНК и уменьшение числа ее копий не только связаны с процессом старения, но и могут быть ассоциированы с наличием хронических неинфекционных патологий, в том числе заболеваний ЖКТ [8, 9]. Различные типы изменений в мтДНК, включая точечные мутации, нестабильность моно- или динуклеотидных повторов, моно- или динуклеотидные вставки, делеции или количественные изменения, обнаружены в солидных опухолях толстой кишки, желудка, печени, почек, мочевого пузыря, предстательной железы и легких [10]. Установлена связь между повреждением мтДНК и сепсис-индуцированной острой почечной недостаточностью [11], сердечно-сосудистыми заболеваниями [12], женским бесплодием [13] и другими патологиями. Делеции в мтДНК являются важным фактором, вызывающим болезнь Альцгеймера, миопатию, синдром Кернса — Сейра, синдром Пирсона, колоректальный рак и другие заболевания [14].
Таким образом, качественный и количественный анализ аберраций мтДНК в перспективе может позволить не только верифицировать диагноз ГЭРБ, но и выявить особенности, ассоциированные с развитием тяжелых форм данной патологии, злокачественной трансформацией клеток и другими патологическими процессами.
Цель исследования: выявление частоты встречаемости повреждений мтДНК в образцах слюны у больных ГЭРБ с эзофагитом разной степени тяжести и у здоровых людей, оценка корреляции количества поврежденной мтДНК со степенью тяжести ГЭРБ.
Содержание статьи
Материал и методы
В исследовании приняли участие 106 мужчин (27 — соматически здоровые, 79 — больные ГЭРБ с эзофагитом), средний возраст которых составил 35,5±3,4 года. Все обследуемые были сопоставимы по возрасту и антропометрическим характеристикам (p>0,05), у всех отмечался отрицательный анамнез в отношении курения. От каждого пациента было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Пациенты с ГЭРБ с эзофагитом находились на диспансерном наблюдении в БУЗ ВО ВГКП № 1 г. Воронежа. Диагноз основного заболевания верифицирован по результатам ФЭГДС, общему анализу крови, клиническим проявлениям (изжога отмечалась в 87% случаев (n=69), боль за грудиной — в 51% (n=40), внепищеводные проявления — в 51% (n=40)). Пациенты с ГЭРБ с эзофагитом были разделены на 3 группы в соответствии с Лос-Анджелесской классификацией [15]: ГЭРБ-А — один или несколько участков поражения слизистой оболочки в виде эрозии или изъязвления менее 5 мм, не выходящего за пределы складки слизистой (n=26); ГЭРБ-В — один или несколько участков поражения слизистой более 5 мм, не выходящего за пределы складки слизистой оболочки (n=25); ГЭРБ-С — поражение двух и более складок слизистой оболочки, в общем занимающее менее 75% окружности пищевода (n=28). Критерием исключения являлась принадлежность к группе ГЭРБ-D (поражение более 75% слизистой оболочки окружности пищевода) в связи с наличием осложненных форм в анамнезе (верифицированная онкопатология верхних отделов ЖКТ), что способно негативно повлиять на оценку количественных повреждений мтДНК и исказить результат. Здоровые обследуемые составили контрольную группу (КГ) (n=27).
Общий анализ крови (ОАК) выполняли в лаборатории БУЗ ВО ВГКП № 1 г. Воронежа на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex XN-550 (Sysmex Corporation, Япония). Регистрировали содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, СОЭ.
Анализ повреждений мтДНК проводили с помощью метода ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Биоматериал — слюна, образцы собирали в стерильные пробирки объемом 5 мл спустя 2 ч после последнего употребления обследуемыми пищи и жидкости. На момент забора биоматериала пациенты не принимали никаких лекарственных препаратов, находились в ремиссии основного заболевания. Образцы слюны замораживали при -17 °С на срок до 4 сут и транспортировали в лабораторию с соблюдением холодовой цепи [16]. ДНК выделяли набором «ПРОБА-ГС» («ДНК-Технология», Россия). Качество полученного продукта оценивали методом электрофореза в 2% агарозном геле.
Осуществляли анализ повреждений мтДНК методом количественной ПЦР-РВ с использованием Encyclo-полимеразы («Евроген», Россия) на термоциклере CFX96TM Real-Time System (Bio-Rad, США), принцип метода подробно описан в работах [17, 18]. Реакционная смесь состояла из следующих компонентов: 0,4 мкл 50х Encyclo-полимеразы, 2 мкл буфера, 0,4 мкл dNTP, 1 мкл SYBR Green I, 1 мкл ДНК-матрицы, по 1 мкл прямого и обратного праймеров. Для длинного (1903 п. н.) фрагмента использовали следующие праймеры: прямой — 5′-AAACCCCATTAAACGCCTGG-3′; обратный — 5′-TCGGAGAATTGTGTAGGCGAAT-3′. Короткую последовательность мтДНК длиной 67 п. н. амплифицировали с помощью следующих праймеров: прямой — 5′-GGCCACAGCACTTAAACACA-3′; обратный — 5′-CCCTAACACCAGCCTAACCA-3′. Условия амплификации для ПЦР-РВ включали: начальную денатурацию при 95 °C в течение 3 мин и 35 циклов, состоящих из стадии денатурации в течение 30 с при 95 °C, отжига праймеров в течение 30 с при 59 °C и элонгации в течение 4 мин 30 с при 72 °C. На последней стадии проводили заключительную элонгацию при 72 °C в течение 4 мин.
Подсчет количества нарушений проводили в программе 2.0.DNADamageCalculator [19] по формуле:
lesions per 10 kb = (1 — 2-(∆long—∆short)) × (10000 [bp] / size of fragment [bp]) ,
где lesions per 10 kb — количество нарушений на 10 000 нуклеотидов; ∆long и ∆short — разность амплификации длинных и коротких фрагментов между опытным образцом и образцом сравнения (образец сравнения программа выбирает самостоятельно по минимальной разнице пороговых циклов амплификации длинных и коротких фрагментов образца); ∆long — ∆short — коэффициент разности амплификации между длинными и короткими фрагментами; size of fragment [bp] — размер фрагмента.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов программ STADIA 8.0 (InCo, Россия) и MedCalc 20.104 (MedCalc Software, Бельгия). Сравнение медианных значений показателей ОАК и количества повреждений мтДНК проводили с использованием критериев Уилкоксона и Ван-дер-Вардена, т. к. распределение большей части показателей отличалось от нормального. Для множественных сравнений применяли поправку Бонферрони (p’<0,01). Влияние фактора заболевания на количество повреждений мтДНК оценивали с помощью однофакторного непараметрического дисперсионного анализа (критерий Крускела — Уоллиса). Для определения критических значений (cut-off point) числа повреждений мтДНК, отделяющих показатели здоровых пациентов от больных, и больных в пределах выделенной группы от других групп, использовали ROC-анализ. Регистрировали площадь под кривой (AUC — Area Under Curve) в координатах «100% — специфичность; чувствительность», критические значения показателя, чувствительность (Se, %) и специфичность (Sp, %) теста. В качестве критического уровня значимости принимали a<5%.
Результаты исследования
Нами был проведен сравнительный анализ показателей ОАК и количества повреждений мтДНК в КГ и группах пациентов с ГЭРБ для выявления различий между группами и нахождения диагностически информативных признаков для оценки степени тяжести заболевания.
Результаты ОАК здоровых обследуемых и пациентов с ГЭРБ представлены в таблице 1. Все исследуемые показатели во всех группах находились в пределах нормы. Статистически значимые различия обнаружены только между медианными значениями количества лейкоцитов у пациентов групп ГЭРБ-А и ГЭРБ-С, в остальных случаях различия наблюдались только на уровне статистической тенденции (см. табл. 1).
Анализ количества повреждений мтДНК, выделенной из образцов слюны обследованных лиц, показал, что их медианный уровень в группе ГЭРБ-С (5,19/10 kb) достоверно превышал аналогичные показатели в остальных группах больных и в КГ (табл. 2).
Однофакторный непараметрический дисперсионный анализ выявил влияние фактора заболевания (рефлюкс-эзофагита) на частоту встречаемости повреждений мтДНК (р=0,0004).
ROC-анализ позволил установить, что количество повреждений мтДНК может служить предиктором тяжелой формы ГЭРБ и позволяет четко отделять группу ГЭРБ-С от КГ и остальных групп сравнения (рис. 1–3, табл. 3).
Анализируемый предиктор (число повреждений мтДНК) характеризуется хорошей (AUC >0,7) и очень хорошей (AUC >0,8) диагностической ценностью в отношении выделения группы больных с тяжелой формой ГЭРБ как из смешанной выборки со здоровыми обследуемыми, так и из выборки больных ГЭРБ с легким, среднетяжелым и тяжелым поражением пищевода. Исследуемый маркер обладает достаточной чувствительностью (64,00–72,00%) и высокой специфичностью (80,77–100,00%). Согласно результатам ROC-анализа пациентов с числом нарушений мтДНК, превышающим 5,12/10kb, следует относить к группе риска наличия тяжелой формы ГЭРБ.
Обсуждение
Кровь как совокупная и чрезвычайно емкая информационная среда управляет множеством одновременно протекающих биологических процессов организма человека и отражает изменения состояния отдельных клеток, тканей, органов и организма в целом в каждый промежуток времени [20]. Поэтому показатели крови активно используются для постановки диагноза и мониторинга состояния пациентов при различных заболеваниях. Однако параметры ОАК находятся под воздействием большого количества разнонаправленно действующих факторов, поэтому они достаточно динамичны и относительно быстро нормализуются при улучшении состояния больного. У пациентов с ГЭРБ в период ремиссии результаты ОАК не отличаются от таковых у здоровых лиц и не выходят за пределы установленных референтных интервалов, поэтому не являются информативными для анализа состояния пациента вне острой фазы заболевания, до наступления клинически выраженного рецидива.
Роль ДНК в патогенезе различных заболеваний и состояний широко обсуждается в настоящее время [21–24]. Так, например, показано, что концентрация внеклеточной ДНК в плазме крови заметно повышается при критических состояниях, таких как тяжелая травма, сепсис, при сосудистых катастрофах, а также физиологических и пограничных состояниях, в том числе при физической нагрузке и остром, и хроническом психоэмоциональном стрессе [22]. Признано, что внеклеточные ядерная и митохондриальная ДНК являются одним из компонентов системы DAMP (damage-associated molecular pattern) — молекулярных паттернов, связанных с повреждением клеток и тканей [24]. Однако количественному анализу повреждений митохондриальная ДНК и их роли в развитии тех или иных патологических состояний посвящено намного меньше работ [25, 26].
Результаты нашего исследования указывают на то, что количество повреждений мтДНК эпителиальных клеток верхних отделов ЖКТ — более прогностически ценный по сравнению с результатами ОАК показатель. Хотя эпителий постоянно обновляется, аберрантные мтДНК наследуются дочерними клетками, так как нарушения мтДНК накапливаются приблизительно в 10 раз быстрее, чем ядерные, а элиминируются медленно, что связано с относительно малоэффективными механизмами репарации в митохондриях [27]. Поэтому, несмотря на временное устранение внешней причины повреждения клеток, эффекты воздействия сохраняются и могут быть обнаружены даже спустя довольно продолжительное время после обострения заболевания. Количество нарушений мтДНК демонстрирует связь со степенью тяжести ГЭРБ. Это обусловлено площадью и глубиной поражения слизистой оболочки пищевода в результате воспаления. Однако метод количественной оценки повреждений мтДНК может быть нечувствителен в начальной стадии заболевания или при легких и среднетяжелых повреждениях исследуемых тканей, так как требуется аккумуляция некой «критической массы» повреждающего воздействия, чтобы исследуемая характеристика (количество повреждений мтДНК) достигла значений, позволяющих достоверно отличать норму от патологии.
Заключение
Для внедрения метода количественной оценки аберраций мтДНК в клиническую практику требуется проведение дополнительных исследований, позволяющих проследить изменение числа повреждений мтДНК в динамике развития ГЭРБ. Преимущества данного метода перед стандартными диагностическими манипуляциями состоят в том, что забор слюны не является инвазивной процедурой, анализ безвреден и безболезнен для пациента, не вызывает физического и психологического дискомфорта, может проводиться неограниченное количество раз, не требует дорогостоящего диагностического оборудования и участия специалиста (как, например, ФЭГДС). Поэтому следует заключить, что анализ повреждений мтДНК в образцах слюны может служить доступным методом, позволяющим выделить группу риска по тяжелому течению ГЭРБ и возможным осложнениям, требующую особого контроля, диспансерного наблюдения, рекомендаций и усиленной терапии. Выявление группы риска по тяжелому течению ГЭРБ с эзофагитом особенно важно и с точки зрения своевременного выявления и предупреждения осложнений, в том числе кровотечений и злокачественных новообразований пищевода и желудка.
Сведения об авторах:
Чижков Павел Андреевич — аспирант кафедры генетики, цитологии и биоинженерии ФГБОУ ВО «ВГУ»; 394018, Россия, г. Воронеж, Университетская пл., д. 1; ассистент кафедры поликлинической терапии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России; 394036, Россия, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10; ORCID iD 0000-0002-5626-0579
Калаева Елена Анатольевна — к.б.н., доцент кафедры биофизики и биотехнологии ФГБОУ ВО «ВГУ»; 394018, Россия, г. Воронеж, Университетская пл., д. 1; ORCID iD 0000-0002-3668-0816
Калаев Владислав Николаевич — д.б.н., профессор, заведующий кафедрой генетики, цитологии и биоинженерии ФГБОУ ВО «ВГУ»; 394018, Россия, г. Воронеж, Университетская пл., д. 1; ORCID iD 0000-0002-4247-4509
Ларина Анна Викторовна — ассистент кафедры физиологии человека и животных ФГБОУ ВО «ВГУ»; 394018, Россия, г. Воронеж, Университетская пл., д. 1; ORCID iD 0000-0001-5389-9580
Лагутина Светлана Николаевна — к.м.н., ассистент кафедры поликлинической терапии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России; 394036, Россия, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10; ORCID iD 0000-0003-3730-5265
Контактная информация: Лагутина Светлана Николаевна, е-mail: svlagutina97@mail.ru
Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.
Конфликт интересов отсутствует.
Статья поступила 30.10.2025.
Поступила после рецензирования 24.11.2025.
Принята в печать 17.12.2025.
About the authors:
Pavel A. Chizhkov — Postgraduate Student at the Department of Genetics, Cytology and Bioengineering, Voronezh State University; 1, Universitetskaya sq., Voronezh, 394018, Russian Federation; Teaching Assistant of the Department of Polyclinic Therapy, N.N. Burdenko Voronezh State Medical University; 10, Studencheskaya str., Voronezh, 394036, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-5626-0579
Elena A. Kalaeva — C. Sc. (Biol.), Assistant Professor of the Department of Biophysics and Biotechnology, Voronezh State University; 1, Universitetskaya sq., Voronezh, 394018, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-3668-0816
Vladislav N. Kalaev — Dr. Sc. (Biol.), Professor, Head of the Department of Genetics, Cytology and Bioengineering, Voronezh State University; 1, Universitetskaya sq., Voronezh, 394018, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-4247-4509
Anna V. Larina — Teaching Assistant at the Department of Human and Animal Physiology, Voronezh State University; 1, Universitetskaya sq., Voronezh, 394018, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-5389-9580
Svetlana N. Lagutina — C. Sc. (Med.), Teaching Assistant at the Department of Polyclinic Therapy, N.N. Burdenko Voronezh State Medical University; 10, Studencheskaya str., Voronezh, 394036, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-3730-5265
Contact information: Svetlana N. Lagutina, e-mail: svlagutina97@mail.ru
Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned.
There is no conflict of interest.
Received 30.10.2025.
Revised 24.11.2025.
Accepted 17.12.2025.
Информация с rmj.ru
Загрузка...
