Липидный анализ слезной жидкости в диагностике дисфункции мейбомиевых желез | Тахауова Л.Р., Гусева А.А., Крылова А.А., Кривошеина О.И.

Введение

Слезная жидкость (СЖ) представляет собой сложную поликомпонентную систему, непрерывно увлажняющую глазную поверхность, в которой активно протекают метаболические, иммунологические, регуляторные и защитные процессы [1, 2].

В нормальных условиях скорость продукции слезы колеблется в диапазоне от 0,5 до 2,2 мкл/мин, скорость оборота — примерно 16% в минуту [3, 4]. Объем слезы на глазной поверхности человека составляет 7–10 мкл, а ее состав очень сложен и включает в себя неорганические электролиты, белки, липиды, холестерин, фосфолипиды и другие продукты обмена жиров, лизоцим, лактоферрин, простагландины, иммуноглобулины, ингибиторы протеолитических ферментов и др. [5–7].

Слезная пленка (СП), покрывающая глазную поверхность, состоит из нескольких слоев: муцинового слоя (толщиной от 0,02 до 0,05 мкм), состоящего из гликопротеинов, водянистого слоя (толщиной 0,7 мкм), содержащего электролиты, пептиды и гликопротеины, и поверхностного липидного слоя (толщиной 0,1 мкм). Поскольку СП также служит оптической преломляющей средой, поддержание ее стабильности играет ключевую роль в обеспечении оптимальной остроты зрения [8–10].

Муциновый слой СП обеспечивает равномерное распределение слезы на гидрофобном эпителии глазной поверхности и сглаживает микронеровности переднего эпителия роговицы. Кроме того, муцин влияет на вязкость СП, способствуя ее стабильности [11–14]. Дефицит муцинового слоя обусловливает десквамацию эпителиоцитов конъюнктивы и роговицы с последующей инициацией воспаления глазной поверхности.

Водянистый слой СП образуется за счет дополнительных слезных желез Вольфринга и Краузе и обеспечивает доставку кислорода и питательных веществ к эпителию роговицы. Данный слой представлен растворимыми в воде электролитами и органическими высокомолекулярными соединениями, содержит ферменты, факторы роста (эпидермальный фактор роста, трансформирующий фактор роста β), защитные факторы (лизоцим, гистамин, простагландины, иммуноглобулины Аs, G, M, D, E), глюкозу, витамины и антиоксиданты [15].

Снаружи водянистый слой СП покрыт довольно тонким липидным слоем. Он играет крайне важную роль в поддержании гомеостаза глазной поверхности, препятствуя как чрезмерному испарению водянистого слоя СП, так и повышенной теплоотдаче с поверхности эпителия роговицы и конъюнктивы. Помимо этого, липидный слой СП обеспечивает гладкость внешней поверхности СЖ, создавая условия для правильного преломления лучей света данной оптической средой [4].

Установлено [16], что при мигательных движениях век происходит изменение структуры слоев липидных молекул СЖ. При полузакрытой глазной щели липидные молекулы формируют так называемую «общую заслонку» толщиной от 25 до 500 нм, состоящую из 50–100 слоев липидов, либо истончаются, равномерно распределяясь по глазной поверхности.

Липиды, входящие в состав СП, синтезируются мейбомиевыми железами (МЖ) и железистыми клетками Цейса и Молля. Липидный состав мейбума значительно отличается от любого другого липидного пула в организме человека. Он представлен двумя слоями: внешним слоем неполярных липидов и внутренним слоем полярных липидов [17]. Полярные липиды обладают положительными и отрицательными зарядами на своих концах, в то время как неполярные липиды лишены заряда.

Уникальность мейбума заключается в особенном сочетании классов липидов, а также в гидроксилировании жирных кислот и спиртов, изо- и антеизоразветвлении мейбомиевых липидов. Основные составляющие мейбума — это нейтральные липиды: эфиры воска и холестерина, диэфиры и триацилглицерины, в меньшем количестве — свободные жирные кислоты, (О-ацил)-ω-гидроксижирная кислота, фосфолипиды, сфингомиелины, керамиды и др. [18].

Неполярные липиды СП

Основными липидами СП являются неполярные липиды, в частности эфиры воска и холестерина, которые синтезируются МЖ и составляют до 70% всего липидного слоя слезы [19, 20].

Эфиры воска в СП образуют внешний барьер, защищающий глазную поверхность от вредных воздействий окружающей среды и препятствующий испарению влаги [19, 20].

Эфиры холестерина в большом количестве обнаруживаются в мейбуме и кожном сале, при этом их содержание в других тканях организма человека невелико. Углеводородные цепочки холестериновых эфиров длинные, разветвленные и параллельно расположены друг к другу, благодаря чему мейбум имеет плотную структуру и относительно высокую температуру плавления [20].

Полярные (амфифильные) липиды СП

В СЖ присутствуют также полярные или амфифильные липиды, которые обладают как гидрофильными, так и гидрофобными концами. Такое строение позволяет данному виду липидов образовывать ламеллярные структуры благодаря притяжению их полярных частей к водному слою СП на границе вода — липиды [21]. Следствием этого является уменьшение поверхностного натяжения с образованием стабильной мультимолекулярной СП и равномерным распределением слезы по поверхности глаза. Доля полярных липидов в мейбуме составляет не менее 16% от общего объема [22].

Основные амфифильные липиды СП — это фосфолипиды и сфингомиелины, располагающиеся преимущественно в подслое полярных липидов [19]. Среди фосфолипидов СП наиболее часто (более 60% случаев) встречаются фосфатидилхолины, в 15% — фосфатидилэтаноламины. При этом в секрете МЖ человека содержание фосфатидилхолинов изолированно или в комбинации со сфингомиелинами составляет не более 0,015–0,2% от общего состава липидов мейбума [19, 20]. Подобное парадоксальное несоответствие высокого содержания фосфолипидов в слезе и незначительного их количества в секрете МЖ, являющемся основным источником липидов СП, делает актуальным вопрос о происхождении фосфолипидов СЖ.

В 2014 г. в составе мейбума здорового человека обнаружен новый тамфифильный вид липидов — холестерилсульфат [23].

Сравнительно недавно установлено, что (О-ацил)-ω-гидроксижирная кислота в равной степени присутствует как в секрете МЖ, так и в СП [21, 24]. Одной из возможных физиологических ролей (О-ацил)-ω-гидроксижирной кислоты является формирование межфазного слоя СП, обеспечивающего ее стабильность. Так, например, снижение концентрации (О-ацил)-ω-гидроксижирной кислоты в СЖ у пациентов с синдромом «сухого глаза» (ССГ) сопровождается значительной дестабилизацией СП [23].

Характерной чертой всех основных классов сложных мейбомиевых липидов, таких как сложные эфиры воска, холестерин и (О-ацил)-ω-гидроксижирная кислота, является максимальная длина основной углеродной цепи, достигающая 36 углеродных остатков.

Дисфункция МЖ

У пациентов с дисфункцией МЖ (ДМЖ) существенно меняются состав и физические свойства липидов, что усугубляет патологические изменения как в самих МЖ, так и в СП [24]. При ДМЖ мейбум становится более густым и имеет более высокую температуру плавления, чем в норме, поэтому для перехода густого секрета МЖ в жидкое состояние требуется дополнительная тепловая энергия (прогревание).

Кроме того, как в секрете МЖ, так и в СП в целом при ДМЖ существенно снижается содержание неполярных липидов (эфиров холестерина и воска) и амфифильных липидов (фосфолипидов и сфингомиелинов), что приводит к ухудшению защитного действия липидного слоя СП и снижению ее стабильности.

Патогенетически различают две формы ДМЖ — рубцовую и нерубцовую [25]. Рубцовая форма ДМЖ возникает при сужении протоков МЖ, например на фоне трахомы и эритемы, что сопровождается уплотнением мейбума и ухудшением его оттока. Нерубцовая форма данной патологии возникает вследствие атрофии МЖ на фоне различных дерматологических заболеваний (акне, псориаз, дерматит), вызывающих гиперкератинизацию их выводных протоков [26–29].

Поскольку МЖ представляют собой основной источник липидов слезы, закупорка их протоков или стаз секрета может приводить к дефициту ключевых липидов СП, что, в свою очередь, приводит к нарушению ее стабильности [29].

Основными причинами качественного изменения мейбума при ДМЖ, согласно общепризнанному мнению [30], являются повышение температуры его плавления и снижение содержания в слезе фосфолипидов и сфингомиелинов.

Установлено, что липиды мейбума пациентов с ДМЖ формируют более упорядоченную и жесткую молекулярную структуру по сравнению с нормальным мейбумом, обладающим неупорядоченной жидкокристаллической структурой [28]. Сильное взаимодействие между молекулами липидов в упорядоченной структуре существенно затрудняет их распад и переход в жидкокристаллическую фазу. Как следствие, температура плавления мейбума при ДМЖ повышается, составляя в среднем 32,2 °C, что на 4 °C превышает нормальный показатель (28,9 °C) [30]. Кроме того, ситуация усугубляется тем, что средняя температура тарзальной конъюнктивы у пациентов с ДМЖ значительно (по меньшей мере на 1,5 °C) ниже, чем в норме, а также ниже средней температуры плавления мейбума [31].

Согласно современным исследованиям [32] при ДМЖ в мейбуме отмечается снижение содержания сложных эфиров воска и холестерина, что приводит к формированию более упорядоченной структуры мейбума и повышению температуры его плавления при данной патологии. Одной из возможных причин подавления синтеза и секреции эфиров воска является присутствие и размножение комменсальных бактерий на краях век [33, 34]. Выделяемые бактериями липолитические ферменты гидролизуют эфиры воска, что приводит к уменьшению их содержания в мейбуме с одновременным увеличением содержания других продуктов этой реакции, таких как свободные жирные кислоты и свободный холестерин. Снижение концентрации неполярных липидов в СП обусловливает появление дефектов наружного — липидного — слоя СП с увеличением скорости испарения слезы.

Необходимо отметить, что патологические изменения полярных липидов СП, обеспечивающие соединение между собой слоя неполярных липидов и водно-муцинового слоя, сопровождаются повышением поверхностного натяжения и нестабильностью СП [31, 33]. В СП пациентов с блефаритами, сухим кератоконъюнктивитом отмечается снижение содержания фосфолипидов и сфингомиелинов.

Анализ липидного состава слезы

Существенную помощь в изучении механизмов развития и прогрессирования различных заболеваний глазной поверхности, таких как ССГ, ДМЖ, рецидивирующий блефароконъюнктивит и др., может оказать липидное картирование, анализирующее липидный состав того или иного биологического материала пациента, например СЖ.

Разделение, идентификация и количественное определение липидов слезы осуществляются с помощью различных аналитических подходов [35, 36]. Учитывая ограниченный объем получаемой для исследования слезы и существенный диапазон массы веществ, входящих в ее состав, рекомендуется проведение жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией [37, 38].

Необходимо отметить, что существенное влияние на результат липидного анализа СЖ оказывают такие этапы исследования, как сбор, хранение и обработка получаемого материала.

Забор проб слезы для липидного анализа

В настоящее время для получения СЖ применяется несколько способов. Одним из весьма распространенных является прямой сбор слезы в стеклянный капилляр, один из концов которого погружается в нижний свод конъюнктивального мешка глаза [39, 40]. Процесс сбора слезы при помощи стеклянного капилляра происходит медленно и прерывисто из-за естественных движений глаз и моргания, что может вызвать заметный дискомфорт у пациента, особенно в случае наличия эрозий на поверхности глаза, воспалительных процессов или ССГ. Необходимо отметить, что использование стеклянного капилляра для отбора слезы требует определенных навыков, так как существует потенциальный риск механического повреждения глазной поверхности. Более того, данный метод сбора слезы может быть неэффективным при выраженном дефиците водного компонента слезы в случае ССГ, болезни Шегрена и хронических воспалительных заболеваний глаз различной этиологии.

Другой широко применяемый метод сбора слезы основан на принципе абсорбции материала исследования с помощью поглощающего материала, помещенного за нижнее веко. С этой целью используются ацетатцеллюлозные фильтры, поливинилацетатные губки, а также тест-полоски Ширмера [41].

При заборе СЖ для исследования ее биохимического состава тест-полоска Ширмера, представляющая собой полоску фильтровальной бумаги шириной 50 мм и длиной 450 мм, после загибания одного из ее концов на 0,5 см помещается загнутым краем в нижний конъюнктивальный свод на 5 мин [42].

Преимуществами данного метода для сбора СЖ является малоинвазивность, простота транспортировки и хранения. Важным доводом в пользу использования тест-полосок Ширмера служит способность получения биологического материала у пациентов с выраженным дефицитом слезы. Кроме того, этот метод сбора не требует специализированного оборудования и, согласно результатам исследований применения тест-полосок Ширмера [43, 44], обеспечивает достоверные данные об объеме слезы и содержании в ней отдельных биохимических компонентов.

Однако при проведении диагностического забора слезы необходимо учитывать, что непосредственное размещение тест-полоски в конъюнктивальной полости исследуемого глаза вызывает рефлекторное слезотечение, потенциально способное менять липидный состав СЖ [45–47]. В связи с этим важным требованием к забору слезы с помощью тест-полосок Ширмера для липидного анализа СЖ, которое должно неукоснительно выполняться, является осторожное и аккуратное размещение тест-полоски за нижним веком исследуемого глаза пациента.

Подготовка и хранение проб

При использовании тест-полосок Ширмера для забора слезы применяют разные методы извлечения липидов из полоски, одним из наиболее простых является центрифугирование. Пропитанную слезой полоску Ширмера отрезают и помещают в пробирку с 500 мкл физиологического раствора хлорида натрия 0,9 г/л. Затем проводится центрифугирование при 3000 оборотов в 1 мин в течение 10 мин, что позволяет элюировать компоненты слезы в физиологический раствор [48].

Определение концентрации липидов в образцах СЖ проводится в соответствии с учетом коэффициента разведения слезы физиологическим раствором. С этой целью осуществляется расчет исходного объема забранной для исследования слезы: если 1,0 мм пропитанной СЖ полоски соответствует 1 мкл ее объема, то фактический объем полученной слезы (V _слезы) в мкл равен длине смоченной зоны полоски в 1,0 мм.

Конечный объем образца (V _{образца}) для лабораторного анализа включает объем забранной СЖ и объем физиологического раствора 500 мкл, используемый для разведения:

V образца = V _слезы + 500 мкл.

Коэффициент разведения (К _разв) образца СЖ рассчитывается по формуле:

К разв = V _{образца} / V _слезы.

Хранение полученных образцов слезы возможно в течение длительного периода времени благодаря применению специального метода высушивания и строгому соблюдению температурного режима: при хранении проб рекомендуемая температура — минус 20 °C, при их транспортировке — минус 80 °C. В случае несоблюдения температурного режима концентрация липидов в образцах СЖ значительно снижается [49]. Четкое соблюдение правил подготовки, хранения и транспортировки проб СЖ позволяет избежать погрешностей в определении количественного состава слезы, что обеспечивает возможность корректной идентификации липидов при различных заболеваниях органа зрения.

Заключение

Слезная пленка представляет собой сложную систему, чувствительную ко многим физиологическим изменениям, в частности к уменьшению содержания в ней неполярных и амфифильных липидов. Уменьшение содержания липидов в СЖ возможно как вследствие стаза секрета или закупорки протоков МЖ при их дисфункции, так и вследствие повышения активности бактериальных липаз, гидролизующих неполярные липиды слезы с образованием побочных продуктов реакции.

Существенную помощь в изучении закономерностей развития и прогрессирования различных заболеваний глазной поверхности может оказать липидный анализ СЖ. Будучи высокоинформативным методом исследования, отличающимся безопасностью и минимальной травматичностью, он обеспечивает получение новых данных фундаментального характера об особенностях СП при различных видах патологии глазной поверхности, а также открывает перспективы установления индивидуальных особенностей течения патологии и выработки персонализированных подходов к лечению в каждом конкретном клиническом случае.

Сведения об авторах:

Тахауова Лилия Равильевна — очный аспирант кафед­ры офтальмологии ФГБОУ ВО СибГМУ Мин­здрава России; 634050, Россия, г. Томск, Московский тракт, д. 2; младший научный сотрудник ФГБУН СНБН Центр ФМБА России; 634013, Россия, г. Северск, пер. Чекист, д. 7, корп. 2; ORCID iD 0000-0002-6261-9795.

Гусева Алина Андреевна ­— ординатор кафед­ры офтальмологии ФГБОУ ВО СибГМУ Мин­здрава России; 634050, Россия, г. Томск, Московский тракт, д. 2; ORCID iD 0009-0009-9832-1710.

Крылова Анна Андреевна — к.м.н., доцент кафед­ры офтальмологии ФГБОУ ВО СибГМУ Мин­здрава России; 634050, Россия, г. Томск, Московский тракт, д. 2; ORCID iD 0000-0001-8009-6302.

Кривошеина Ольга Ивановна — д.м.н., профессор, заведующая кафедрой офтальмологии ФГБОУ ВО СибГМУ Мин­здрава России; 634050, Россия, г. Томск, Московский тракт, д. 2; ORCID iD 0000-0001-7509-5858.

Контактная информация: Тахауова Лилия Равильевна, e-mail: tahauovaa@gmail.com.

Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.

Конфликт интересов отсутствует.

Статья поступила 05.02.2024.

Поступила после рецензирования 29.02.2024.

Принята в печать 27.03.2024.

About the authors:

Liliya R. Takhauova — postgraduate student of the Department of Ophthalmology, Siberian State Medical University; 2, Moskovskiy tract, Tomsk, 634050, Russian Federation; junior researcher, Seversk Biophysical Scientific Center of the Federal Medical Biological Agency of Russia; 7, build. 2, Chekist lane, Seversk, 634013, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-6261-9795.

Alina A. Guseva — resident of the Department of Ophthalmology, Siberian State Medical University; 2, Moskovskiy tract, Tomsk, 634050, Russian Federation; ORCID iD 0009-0009-9832-1710.

Anna A. Krylova — C. Sc. (Med.), associate professor of the Department of Ophthalmology, Siberian State Medical University; 2, Moskovskiy tract, Tomsk, 634050, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-8009-6302.

Olga I. Krivosheina — Dr. Sc. (Med.), Professor, Head of the Department of Ophthalmology, Siberian State Medical University; 2, Moskovskiy tract, Tomsk, 634050, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-7509-5858.

Contact information: Lilliya R. Takhauova, e-mail: tahauovaa@gmail.com.

Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned.

There is no conflict of interest.

Received 05.02.2024.

Revised 29.02.2024.

Accepted 27.03.2024.