Возможности персонифицированного подхода к лечению гепатита С на основании разработанных генетических тестов определения варианта полиморфизма гена ИЛ

О. О. Знойко*, доктор медицинских наук, профессор
Е. В. Пыпкина*
Е. А. Климова*, доктор медицинских наук, профессор
К. Р. Дудина*, кандидат медицинских наук
А. Н. Козина*
Д. Д. Абрамов**
Т. В. Петрова**
Н. П. Блохина***, доктор медицинских наук, профессор
Н. Д. Ющук*, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН
*МГМСУ, **ЗАО «НПФ ДНК-Технология», ***ГУЗ ИКБ № 1, Москва

Несмотря на большие достижения в изучении патогенеза острого и хронического гепатита С, остается много нерешенных вопросов в области диагностики, профилактики и лечения этого инфекционного заболевания [1, 2]. До настоящего времени не разработана профилактическая вакцина, предупреждающая заражение вирусом гепатита С, не разработаны четкие критерии реконвалесценции, существует проблема неэффективности лечения основными противовирусными препаратами — интерфероном и рибавирином, а у пациентов без достижения вирусологического ответа на фоне лечения пегиллированным интерфероном (Пег-ИФН) и рибавирином в результате тройной терапии удается достичь эффекта только в 33% случаев [3]. Последние годы все большее внимание клиницистов привлекает возможность персонифицированного подхода к лечению заболеваний, основанного на генетических особенностях человека, а в области лечения вирусных гепатитов С и В интенсивно изучаются генетически детерминированные факторы организма человека, которые определяют предрасположенность к благоприятному или неблагоприятному исходу противовирусной терапии (ПВТ). В 2009 году были опубликованы первые работы, показавшие, что в руках клиницистов появился новый генетически детерминированный прогностический фактор эффективности ПВТ — вариант однонуклеотидного полиморфизма гена человека, кодирующего интерферон лямбда (ИФН-лямбда), который принадлежит к семейству интерферонов III типа [4–6].

Однонуклеотидные полиморфизмы определяют различия между людьми в определенных генах. Существуют аллели одного гена, и генотип каждого человека формируется из комбинации аллелей, полученных от матери и от отца (каждый человек является гомозиготным или гетерозиготным по данному признаку). Геномные вариации могут быть причиной изменения экспрессии генов, процессинга генных продуктов (белков) или повреждения функциональной активности белков. Чтобы выявить общие генетические факторы, которые влияют на течение болезней или ответ на лекарства, выполняются исследования определенных ассоциаций на базе всего генома (genome-wide association study — GWAS) в больших популяциях (1500 человек и более). Понятно, что поиск таких клинически значимых вариаций можно сравнить с образом поиска иголки в стоге сена [5, 7].

В 2009 году вышла первая публикация (Ge D. et al., Nature) о значении полиморфизма ИЛ-28 В в достижении устойчивого вирусологического ответа (УВО) на фоне лечения Пег-ИФН и рибавирином больных хроническим гепатитом С (ХГС). По результатам GWAS на 1600 пациентах был выполнен сравнительный анализ генетических ассоциаций с частотой достижения УВО в исследуемой группе. Показано, что полиморфизм rs12979860 гена ИЛ-28В оказывает существенное влияние на частоту достижения УВО. Так, у пациентов белой расы — носителей генотипа СС (т. е. гомозиготы по аллели С) регистрируется 2-кратная разница (95%, ДИ 1,8–2,3) в частоте достижения УВО по сравнению с носителями генотипов СТ и ТТ полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28В. Подобная частота достижения УВО в зависимости от варианта генотипа данного полиморфизма человека выявлена как у афроамериканцев, так и у американцев испанского происхождения. Отмечено, что частота распространения аллели С значительно меньше у больных ХГС по сравнению с группой контроля (здоровые лица) той же этнической принадлежности. Это предполагает ассоциацию аллели С с более высокой частотой спонтанного клиренса ВГС [5].

В исследованиях Rauch A. et al. (2010) и Thomas D. L. et al. (2009) оценено клиническое значение другого варианта полиморфизма ИЛ-28В — rs8099917 в качестве предиктора как спонтанной элиминации ВГС, так и предиктора эффективности противовирусной терапии Пег-ИФН и рибавирином. Минорная аллель g полиморфизма rs8099917 гена ИЛ-28В ассоциировалась с переходом острого гепатита С в ХГС и неэффективностью ПВТ у пациентов с генотипом 1 и 4 ВГС [4, 6].

Таким образом, варианты полиморфизма rs8099917 и rs12979860 гена ИЛ-28В имеют существенное значение при оценке вероятности спонтанной элиминации вируса и эффекта ПВТ.

Показано, что существует связь определенного варианта полиморфизма гена ИЛ-28В с вирусной кинетикой на фоне ПВТ: у гомозигот по аллели С полиморфизма rs12979860 и инфицированных генотипами 1 или 4 ВГС наблюдались более высокие темпы снижения уровня виремии ВГС в первые 24 часа после первой инъекции ИФН по сравнению с пациентами — носителями СТ и ТТ генотипов полиморфизма rs12979860. Кроме того, пациенты с генотипом 1 ВГС и гомозиготы СС полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28В достоверно чаще достигали быстрого вирусологического ответа — БВО (38% против 12%) и УВО (79% против 43%) по сравнению с носителями Т аллели данного полиморфизма. Убедительные данные о том, что реализация влияния полиморфизма ИЛ-28В на достижение УВО происходит посредством достижения у большинства пациентов раннего вирусологического ответа (РВО), были получены и другими исследователями [8, 9].

Другие два значимые прогностические факторы, такие как исходный уровень вирусной нагрузки ВГС и стадия фиброза печени на начало ПВТ, также имели значение в развитии УВО у пациентов как с благоприятным, так и с неблагоприятным вариантом полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28В [8]. Это говорит о невысокой индивидуальной предсказательной значимости данного генетического предиктора, если использовать его изолированно, поскольку этот фактор модифицируется остальными характеристиками пациента (стадией фиброза печени, исходным уровнем виремии и др.).

Субанализ третьей фазы клинического исследования эффективности тройной терапии с включением ингибиторов протеазы показал, что полиморфизм ИЛ-28В перестает играть существенную роль в достижении УВО на фоне тройной терапии. Такие же данные получены в ряде клинических испытаний с включением новых противовирусных агентов [10, 11]. Однако, учитывая высокую стоимость тройной терапии ХГС, наличие широкого спектра дополнительных побочных эффектов на фоне лечения Пег-ИФН, рибавирином и ингибиторами протеазы, необходимо признать, что значительная часть пациентов будет продолжать получать двойную схему терапии и вариант полиморфизма ИЛ-28В будет оставаться важнейшим фактором, который необходимо будет учитывать наряду с другими базовыми характеристиками пациента в качестве предиктора успеха терапии.

Учитывая актуальность изучения генетически детерминированных факторов человека — предикторов ответа на ПВТ больных ХГС, на когорте больных ХГС и здоровых доноров г. Москвы было изучено распределение определенных вариантов полиморфизма гена ИЛ-28B в популяции и их значение в частоте достижения УВО на фоне комбинированной ПВТ интерфероном и рибавирином.

Материалы и методы. В исследование включено 176 пациентов с ХГС (у всех до начала лечения выявлена РНК ВГС в крови методом ПЦР) и 92 донора крови с отсутствием антител к вирусу гепатита С в крови. Средний возраст больных ХГС составил 39,08 ± 1,2 (от 19 до 74 лет), среди них 97 мужчин и 79 женщин. Давность обнаружения анти-ВГС в крови пациентов, включенных в исследование, в большинстве (46%) случаев составила от 1 до 5 лет.

У всех пациентов, включенных в исследование, проводилось определение полиморфизма rs12979860 (генотипы человека СС, СТ или ТТ) и rs8099917 (генотипы человека ТТ, Тg или gg) гена ИЛ-28B с помощью метода генотипирования, представляющего собой модифицированный метод «примыкающих проб» и выявляющего однонуклеотидные замены в генах. Кровь пациентов была использована для выделения геномной ДНК после подписания информированного согласия.

Выделение геномной ДНК, разведение и фасовку ДНК осуществляли при помощи роботизированного многофункционального диспенсора Biomeck Workstaion 2000 (Beckman Coulter). Выделенная геномная ДНК разлита объемом по 200 мкл в мелкие пластмассовые пробирки и хранится в морозильной камере при температуре 18–20 °С. Наличие или отсутствие УВО у больных ХГС после проведенной ПВТ оценивалось на основании выявления РНК ВГС в крови с применением метода ПЦР чувствительностью 50 МЕ/мл.

Рис. 1. Распределение сочетаний аллелей С и Т rs12979860 и Т и g rs8099917 гена ИЛ 28В у больных ХГС и здоровых доноров

Собственные результаты и обсуждение. В ходе проведенного генетического анализа выявлено, что в целом частота встречаемости неблагоприятных генотипов человека СТ и ТТ полиморфизма rs12979860 и Тg и gg полиморфизма rs8099917 гена ИЛ-28B достоверно выше среди больных ХГС, в то время как благоприятные варианты генотипов СС полиморфизма rs12979860 и ТТ полиморфизма rs12979860 регистрируются достоверно чаще у здоровых доноров.

Рис. 2. Распределение сочетаний аллелей С и Т по rs12979860 у пациентов с 1-м генотипом ВГС (n = 18), с достижением УВО на ПВТ Пег-ИФ и рибавирином

Данные результаты согласуются с результатами Thomas D. L. [4], Tilmann H. L. [7], поскольку демонстрируют, что у больных ХГС реже выявляются протективные генотипы СС (rs12979860) и ТТ (rs8099917) гена ИЛ-28В по сравнению со здоровыми донорами, очевидно за счет того, что именно у пациентов с наличием таких генотипов чаще происходит спонтанная элиминация вируса и реже происходит хронизация инфекции.

Среди больных ХГС, включенных в исследование, у 84 на момент генетического анализа закончена ПВТ Пег-ИФН или стандартным ИНФ (Ст-ИФН) в комбинации с рибавирином, длительность которой определялась генотипом ВГС (24 или 48 недель). Средний возраст пациентов, получивших ПВТ, составил 38,9 ± 1,4 (от 24 до 68 лет), среди них 51 мужчина и 33 женщины. В анализ эффективности ПВТ не включались пациенты с фиброзом печени 3-й стадии и выше, для исключения влияния этого фактора на эффективность терапии при анализе генетически детерминированных предикторов эффективности ПВТ. В 66,7% (n = 56) случаев больные ХГС получали ПВТ Пег-ИФН и рибавирином (33 больных ХГС, инфицированные 1-м генотипом ВГС, и 23 пациента, инфицированные 2-м и 3-м генотипами ВГС), из них УВО достигли 18 (54,5%) пациентов с 1-м генотипом и 20 (87%) с другими генотипами ВГС. В 33,3% (n = 28) случаев больные ХГС получали ПВТ Ст-ИФН и рибавирином (13 больных ХГС, инфицированные 1-м генотипом ВГС, и 15 больных ХГС, инфицированные другими генотипами ВГС), из них УВО достигли 10 (76,9%) пациентов с 1-м генотипом ВГС и 11 (73,3%) пациентов с другими генотипами ВГС.

Рис. 3. Распределение сочетаний аллелей С и Т по rs12979860 у пациентов с 1-м генотипом ВГС (n = 10), с достижением УВО на ПВТ Ст-ИФ и рибавирином

При анализе частоты выявления вариантов полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B среди больных ХГС, инфицированных 1-м генотипом ВГС, с УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН с рибавирином в 44,4% (8/18) случаев выявлен благоприятный генотип СС, в 38,9% (7/18) неблагоприятный генотип СТ и в 16,7% (3/18) неблагоприятный генотип ТТ данного полиморфизма (рис. 2). Среди больных ХГС, инфицированных 1-м генотипом ВГС, с УВО на ПВТ Ст-ИФН и рибавирином в 80% (8/10) случаев выявлен благоприятный генотип СС и в 20% (2/10) неблагоприятный генотип СТ полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-2B (рис. 3).

При анализе частоты выявления полиморфизма rs8099917 гена ИЛ-28B среди пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС, с достижением УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН и рибавирином благоприятный генотип ТТ встречался в 61,1% (11/18) случаев, у 33,3% (6/18) пациентов генотип Тg, в 5,6% (1/18) генотип gg данного полиморфизма. Среди пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС, с достижением УВО на ПВТ Ст-ИФ и рибавирином благоприятный генотип ТТ полиморфизма rs8099917 ИЛ-28B встречался в 100% случаев.

Сравнительный анализ не выявил достоверных различий в распределении определенных генотипов полиморфизмов rs12979860 и rs8099917 гена ИЛ-28B у больных ХГС, получавших лечение Пег-ИФН и рибавирином с достижением УВО, однако у пациентов, выздоровевших в результате ПВТ Ст-ИФ и рибавирином, такие различия получены и достоверно чаще выздоравливали пациенты, имеющие благоприятный генотип СС полиморфизма rs12979860, а по rs8099917 гена ИЛ-28B УВО на ПВТ Ст-ИФ и рибавирином достигнут только у пациентов с благоприятным генотипом ТТ.

При анализе частоты выявления полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B среди больных ХГС, инфицированных 2-м, 3-м генотипами ВГС, с УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН с рибавирином обнаружено, что в 45% (9/20) случаев регистрируется благоприятный генотип СС, в 50% (10/20) неблагоприятный генотип СТ и в 5% (1/20) неблагоприятный генотип ТТ данного полиморфизма. Среди больных ХГС, инфицированных 2-м и 3-м генотипами ВГС, с УВО на фоне ПВТ Ст-ИФН и рибавирином в 72,7% (8/11) случаев выявлен благоприятный генотип СС, в 27,3% (3/11) неблагоприятный генотип СТ полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B.

Достоверность

Рис. 4. Распределение сочетаний аллелей С и Т по rs12979860 у пациентов с 1-м генотипом HCV (n = 15), без достижения УВО на ПВТ Пег-ИФ и рибавирином

При анализе частоты выявления полиморфизма rs8099917 гена ИЛ-28B среди пациентов, инфицированных 2-м и 3-м генотипами ВГС, с достижением УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН и рибавирином, выявлено, что благоприятный генотип ТТ встречался в 60% (12/20) случаев, в 35% (7/20) генотип Тg, в 5% (1/20) генотип gg данного полиморфизма. Среди пациентов, инфицированных 2-м и 3-м генотипами ВГС, с достижением УВО на фоне ПВТ Ст-ИФН и рибавирином благоприятный генотип ТТ полиморфизма rs8099917 ИЛ-28B встречался в 90,9% (10/11) случаев, в то время как неблагоприятный генотип Тg только у 9,1% (1/11) больных. Таким образом, у больных ХГС, инфицированных не первым генотипом ВГС с достижением УВО, наибольшее влияние варианта полиморфизмов rs12979860 и rs8099917 гена ИЛ-28B отмечено в группах пациентов, получавших Ст-ИФН и рибавирин.

При исследовании полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B среди больных ХГС, инфицированных 1-м генотипом ВГС, без достижения УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН с рибавирином в 6,7% (1/15) случаев выявлен благоприятный генотип СС, в 60% (9/15) неблагоприятный генотип СТ и в 33,3% (5/15) неблагоприятный генотип ТТ данного полиморфизма (см. рис. 4). В данной группе достоверно чаще у пациентов регистрируются неблагоприятные генотипы (СТ и в целом СТ + ТТ) по сравнению с благоприятным генотипом СС полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B (р = 0,0019 и р = 0,00001 соответственно).

Рис. 5. Распределение сочетаний аллелей Т и g без достижения УВО на ПВТ Пег-ИФ и рибавирином

Среди больных ХГС, инфицированных 1-м генотипом ВГС, без УВО на фоне ПВТ Ст-ИФН и рибавирином в 100% случаев выявлен генотип СТ полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B (благоприятный генотип СС среди пациентов, не достигших УВО, не встречался).

При анализе частоты выявления полиморфизма rs8099917 гена ИЛ-28B среди пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС, без достижения УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН и рибавирином обнаружено, что благоприятный генотип ТТ встречался достоверно реже по сравнению с неблагоприятным генотипом Тg (26,7%, 4/15 и 73,3%, 11/15 соответственно, р = 0,01), рис. 5.

Среди пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС, без достижения УВО на фоне ПВТ Ст-ИФН и рибавирином благоприятный генотип ТТ полиморфизма rs8099917 гена ИЛ-28B встречался в 33,3% (1/3) случаев и в 66,7% (2/3) его неблагоприятный генотип Тg, в то время как неблагоприятный генотип СТ rs12979860 гена ИЛ-28B в этой группе пациентов встречался в 100% (3/3) случаев.

В связи с малым количеством пациентов, инфицированных 2-м и 3-м генотипами ВГС, без достижения УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН и рибавирином и больных ХГС, не ответивших на ПВТ Ст-ИФН, статистическая обработка данных не проводилась.

Сочетание благоприятных генотипов, а именно СС полиморфизма rs12979860 и ТТ полиморфизма rs8099917 гена ИЛ-28B (генотип СС-ТТ), встречалось у 36,4% (64/176) больных ХГС и у 38 пациентов среди всех больных ХГС, получивших ПВТ. В данной группе в 81,6% (31/38) случаев был достигнут УВО после лечения.

При анализе частоты достижения УВО среди больных ХГС, инфицированных 1-м генотипом ВГС и наличием благоприятного генотипа СС полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B (n = 17) установлено, что УВО удалось достигнуть в 88,8% (8/9) случаев на фоне ПВТ Пег-ИФН и рибавирином и 100% (8/8) на фоне ПВТ Ст-ИФН и рибавирином. Среди 19 больных ХГС, инфицированных 2-м и 3-м генотипами ВГС и наличием благоприятного генотипа СС полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B, УВО удалось достигнуть у 81,8% (9/11) пациентов на ПВТ Пег-ИФН и рибавирином и у 100% (8/8) пациентов на фоне ПВТ Ст-ИФ и рибавирином. Из 29 пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС, с неблагоприятными вариантами генотипов СТ и ТТ полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28B только 41,7% (10/24) пациентов достигли УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН и рибавирином и 40% (2/5) на фоне ПВТ Ст-ИФН и рибавирином. У 19 пациентов, инфицированных 2-м и 3-м генотипами ВГС, встречались неблагоприятные варианты генотипов СТ и ТТ по полиморфизму rs12979860 гена ИЛ-28B, среди них 91,7% (11/12) пациентов достигли УВО на фоне ПВТ Пег-ИФН и рибавирином и 42,9% (3/7) больных достигли УВО на фоне ПВТ Ст-ИФН и рибавирином. Сравнение частоты достижения УВО в группе пациентов с наличием благоприятного генотипа СС и неблагоприятных генотипов (СТ + ТТ) полиморфизмов rs12979860 гена ИЛ-28B представлено на рис. 6.

Рис. 6. Различие в частоте достижения УВО у пациентов с благоприятным вариантом генотипа СС полиморфизма rs12979860 и у пациентов с неблагоприятными вариантами генотипов (СТ + ТТ) гена ИЛ-28В после курса ПВТ Пег-ИФН и Ст-ИФН с рибавирином

Из данных, представленных на рис. 6, можно сделать предварительное заключение, что больным ХГС с наличием благоприятного генотипа полиморфизма rs12979860 гена ИЛ-28В возможно назначение как Пег-ИФН, так и Ст-ИФН с рибавирином, так как у данных пациентов высока вероятность достижения УВО. При этом частота достижения УВО не различается у пациентов с неблагоприятными генотипами rs12979860, инфицированных 1-м генотипом ВГС, как на Ст-ИФН, так и на Пег-ИФН (41,7% и 40% соответственно), однако различается у пациентов, инфицированных 2-м и 3-м генотипами ВГС, в зависимости от вида полученной ПВТ (Пег-ИФН или Ст-ИФН).

Заключение. Данное пилотное ретроспективное исследование на относительно небольшой группе больных ХГС демонстрирует предварительные результаты, свидетельствующие о существенном значении вариантов полиморфизма гена ИЛ-28B, как rs12979860, так и rs8099917, в достижении УВО в результате ПВТ. Показано, что носители благоприятных аллелей указанных полиморфизмов гена ИЛ-28B чаще отвечают как на Пег-ИФН, так и на Ст-ИФН в сочетании с рибавирином. Однако очевидно, что индивидуальное предсказательное значение вариантов полиморфизма гена ИЛ-28B пока невысоко, так как среди пациентов с УВО часто встречаются и пациенты с неблагоприятными вариантами аллелей rs12979860 и rs8099917. Дополнительные исследования позволят уточнить возможность использования двух вариантов полиморфизма гена ИЛ-28B в сочетании с другими факторами пациента (фиброз печени, уровень вирусной нагрузки ВГС, наличие или отсутствие БВО на фоне ПВТ). Дальнейшие исследования позволят выделить группу больных ХГС с различными генотипами ВГС и определенными генетически детерминированными факторами, у которых назначение Ст-ИФН и рибавирина будет не менее эффективно, чем Пег-ИФН и рибавирина. Результаты таких исследований позволят снизить экономические затраты на лечение больных ХГС.

Литература

1. Ghany M. G., Strader D. B., Thomas D. L., Seeff L. B. Diagnosis, management and treatment of hepatitis C: an update. American Association for the Study of Liver Diseases // Hepatology. 2009, Apr; 49 (4): 1335–1374.
2. Craxi A. et al. EASL Clinical Practice Guidelines: management of hepatitis C virus infection // J Hepatology. 2011, Aug; 55 (2): 245–64.
3. McHutchison J. G., Manns M. P., Muir A. J. PROVE3 Study Team. Telaprevir for previously treated chronic HCV infection // N Engl J Med. 2010, Apr 8; 362 (14): 1292–1303.
4. Thomas D. L., Thio C. L., Martin M. P. et al. Genetic variation in IL28 B and spontaneous clearance of hepatitis C virus // Nature. 2009. Vol. 461, № 7265. P. 798–801.
5. Ge D., Fellay J., Thompson A. J. et al. Genetic variation in IL28 B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance // Nature. 2009. Vol. 461, № 7262. P. 399–401.
6. Rauch A., Kutalik Z., Descombes P. et al. Genetic variation in IL28 B is associated with chronic hepatitis C and treatment failure: a genome-wide association study // Gastroenterology. 2010. Vol. 138, № 4. P. 1338–1345.
7. Tillmann H. L., Thompson A. J., Patel K. et al. A polymorphism near IL28 B is associated with spontaneous clearance of acute hepatitis C virus and jaundice // Gastroenterology. 2010, Nov; 139 (5): 1586–92.
8. Stattermayer A. F., Stauber R., Hofer H. et al. Impact of IL28B genotype on the early and sustained virologic response in treatment-naive patients with chronic hepatitis C // Clin Gastroenterol Hepatol. 2011, Apr; 9 (4): 344–350.
9. Thompson A. J., Muir A. J., Sulkowski M. S. et al. Interleukin-28 B polymorphism improves viral kinetics and is the strongest pretreatment predictor of sustained virologic response in genotype 1 hepatitis C virus // Gastroenterology. 2010, Jul; 139 (1): 120–129.
10. Morgan T. R., O’Brien T. R. IL28B-Genotype Testing Now and in the Era of Direct-Acting Antiviral Agents // Clin Gastroenterol Hepatol. 2011, Apr; 9 (4): 293–294.
11. Lange C. M., Zeuzem S. IL28B single nucleotide polymorphisms in the treatment of hepatitis C // J Hepatol. 2011, Mar 24. [Epub ahead of print].

Статья опубликована в журнале Лечащий Врач