Особенности полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы у детей с идиопатическим синдромом слабости синусового узла

Е. В. Анциферова*, 1
С. Ю. Никулина*, доктор медицинских наук, профессор
Е. Ю. Емельянчик*, доктор медицинских наук, профессор
Л. Н. Анциферова**
В. Н. Максимов***, доктор медицинских наук
Е. П. Кириллова*, кандидат медицинских наук
А. А. Чернова*, кандидат медицинских наук
Н. В. Зайцев*
А. Ю. Мишута**
* ГБОУ ВПО КрасГМУ им. В. Ф. Войно-Ясенецкого МЗ РФ, Красноярск
** КГБУЗ КККДБ, Красноярск
*** ФГБГУ НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск

Оксид азота (NO) — основной эндотелиальный фактор релаксации — экспрессируется практически во всех типах клеток миокарда. Вызывает расслабление гладкой мускулатуры сосудов, участвует в поддержании тонуса сосудистой стенки, обладает пролиферативными и противовоспалительными свойствами [1]. Различают несколько изоформ NO-синтаз с различной локализацией, регулированием и каталитическими свойствами, впервые описанными в 1989 г. Основное различие между изоформами состоит в количестве синтезируемого NO, продолжительности процесса синтеза, индуцируемости и тканевой специфичности [2].

1-й тип — NO-синтаза нервной ткани, ее ген картирован в хромосоме 12q24.2-12q24.3, имеет 29 экзонов, 28 интронов [3]. 3-й тип — эндотелиальная NO-синтаза (Type III, NOS-3, eNOS), участвует в синтезе NO эндотелием и регуляции сосудистого тонуса. Ее ген локализован в хромосоме 7q35-36, имеет 26 экзонов, 25 интронов и кодирует белок с молекулярной массой 135 кДа, состоящий из 1203 аминокислот. Эти два типа NO-синтаз считаются конституциональными, оказывают влияние на сократительную функцию сердца [2, 4]. 2-й тип — индуцибельная NO-синтаза, вырабатывается в сердце при патологических процессах, ген ее картирован в хромосоме 17 cen-q11.2, имеет 26 экзонов, 25 интронов [5].

eNOS участвует в синтезе NO эндотелием и, следовательно, в регуляции сосудистого тонуса, кровотока и артериального давления. Отвечает за большую часть NO, расширяет все типы кровеносных сосудов, стимулируя растворимые гуанилатциклазы, и увеличивает циклический гуанозинмонофосфат в гладкомышечных клетках [6], генерирует вазопротективные молекулы NO, является мощным ингибитором агрегации и адгезии тромбоцитов [7]. Исследования, проведенные H. Wang и соавт. в 2008 г., показали, что eNOS играет важную роль в предупреждении желудочковых аритмий [8].

Существует ряд полиморфизмов гена, кодирующего eNOS, часть из которых связаны с изменением в плазме крови количества NO [3]: замещение гуанина тимидином в 894 позиции в экзоне 7 (894G>T полиморфизм), связанный с уменьшением базального производства NO [9]; полиморфизм в промоторе 786T>C приводит к значительному сокращению количества eNOS [10]. Полиморфизм в 4-м интроне (27 пн), представленный двумя аллелями: b, в котором имеются 5 повторов длиной 27 пн, и а, в котором только 4 таких повтора [3]. Исследования С. Fatini и соавт. в 2004 г., показали связь генотипа 4a/4a с возникновением острого коронарного синдрома, в особенности с острым инфарктом миокарда [11]. Кроме того, в 2012 г. китайские ученые в анализе американских пациентов установили связь генотипа 4 а/4 а с повышенным риском ишемического инсульта [12].

Учитывая физиологическую роль еNOS и данные преды­дущих исследований, мы предположили, что изучение частот аллелей гена eNOS у детей с идиопатическим синдромом слабости синусового узла (СССУ) позволит уточнить патогенетические механизмы развития заболевания, а в последующем молекулярно-генетические данные будут полезны для обоснования тактики ведения больных.

Материалы и методы исследования

Обследовано 90 детей с дисфункцией синусового узла (по клинико-электрокардиографическим критериям классификации М. А. Школьниковой). Для верификации диагноза синдрома слабости синусового узла всем детям было проведено клинико-инструментальное обследование: клинический осмотр, электрокардиография на 12-канальном электрокардиографе на аппарате Shiller AG, эхокардиография с цветным допплеровским картированием на аппаратах HDA 5000, Logiq 400, Phillips HD 11, холтеровское мониторирование электрокардиограммы (ЭКГ) в течение 24 ч на аппарате «Schiller mt-200 holter-ecg», атропиновая проба (для исключения вегетативного влияния на сердечный ритм).

Диагноз «идиопатический СССУ» был поставлен 53 детям (58,9 ± 5,2% наблюдаемых).

Критериями включения в группу были: клинически очевидный СССУ, электрокардиографическое подтверждение заболевания, согласие родителей или ребенка старше 13 лет на участие в исследовании. Критерии исключения: вегетативная дисфункция синусового узла, отказ родителей или ребенка старше 13 лет от участия в исследовании.

Медиана возраста пациентов составила 16,0 лет [14,0; 16,0]. В основной группе преобладали мальчики — 45 пациентов (84,9 ± 4,9%), медиана возраста — 16,0 [14,0; 16,0]; в группу вошли 8 девочек (15,1 ± 4,9%), медиана возраста которых составила 15,1 [13,0; 15,0]. Группа сравнения включила 102 здорового ребенка в возрасте 15,0 лет [14,0; 16,0]. Среди них было 90 мальчиков (88,2 ± 3,2%), медиана возраста — 15,0 [15,0; 16,0] и 12 девочек (11,8 ± 3,2%), медиана возраста — 15,0 [14,8; 15,3].

Клинические проявления СССУ у больных включали синкопальные состояния (53 ± 7,1%), головокружения (76,5 ± 6,0%), ощущение перебоев в области сердца (41,2 ± 7,0%), приступы немотивированной слабости (40 ± 6,9%), повышенную утомляемость (37 ± 6,8%), плохую переносимость физических нагрузок (42 ± 7,0%). Всем детям была проведена кардио- и нейрометаболическая терапия, антиоксидантная терапия.

Дети с 1-м, 2-м и 4-м вариантами СССУ получали периферические холинолитики (Беллатаминал по 1 таблетке 2 раза в день курсом не более 6 мес).

Детям с синдромом тахибрадикардии назначалась антиаритмическая терапия — амиодарон в поддерживающей дозе 5 мг/кг/сут длительностью от 3 до 6 месяцев, под контролем функционального состояния щитовидной железы. Двум пациентам с данным вариантом СССУ, с учетом недостаточной эффективности медикаментозного лечения, были имплантированы кардиовертеры-дефибрилляторы, одной девочке был имплантирован электрокардиостимулятор и в течение 5 лет проведены 3 операции радиочастотной аблации. Всем больным с 4-м вариантом СССУ в период от 2 недель после постановки диагноза до 1 месяца была обеспечена постоянная электрокардиостимуляция.

Молекулярно-генетическое исследование у детей с идиопатическим СССУ проводилось в лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний ФГБУ НИИ терапии СО РАМН г. Новосибирска: были взяты образцы крови 155 человек, из которых 53 — дети с идиопатическим СССУ и 102 ребенка группы сравнения. Все родители больных детей и дети, достигшие возраста 14 лет, подписывали форму информированного согласия на исследование. Работа была одобрена на заседании этического комитета КрасГМУ им. В. Ф. Войно-Ясенецкого от 18.01.2011.

Экстракция ДНК из крови осуществлялась методом фенол-хлороформной экстракции [13, 14]. Генотипирование VNTR полиморфизма гена eNOS проводили через амплификацию соответствующего локуса гена и анализ длины продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для ПЦР использовали фланкирующие праймеры 5’-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3’ (прямой) и 5’-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3′ (обратный). В случае аллеля b амплифицируется ПЦР-продукт длиной 420 нуклеотидных пар, в случае аллеля a — ПЦР-продукт длиной 393 нуклеотидных пар [15].

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ BIOSTAT 2009. На первом этапе определяли частоты аллелей и генотипов изучаемого гена, затем — соответствие распределения аллелей и генотипов по равновесию Харди–Вайнберга. Описательная статистика исследуемых качественных признаков представлена абсолютными значениями, процентными долями и их стандартными ошибками. Сравнительный анализ частот аллелей и полиморфизмов гена eNOS у больных с СССУ и группой сравнения выполнялся с использованием критерия χ² с поправкой на непрерывность. Различия оценивали как статистически значимые, начиная со значения p < 0,05.

Для определения связи синдрома слабости синусового узла с одним из генотипов гена eNOS рассчитывалось отношение шансов (ОШ), характеризующее относительный риск развития заболевания у обследуемых с одним из вариантов генотипа, учитывался доверительный интервал отношения шансов (ДИ ОШ):

ОШ = А × С/В × D,

где А — число детей с одним из вариантов генотипа в основной группе; В — число обследуемых с аналогичным вариантом генотипа в группе сравнения; С — число детей основной группы, не имеющих данного варианта генотипа в основной группе; D — число наблюдаемых группы сравнения с другими вариантами генотипа.

Результаты и их обсуждение

По полиморфизму 4a/4b гена eNOS было проведено генотипирование у 53 детей с идиопатическим СССУ и у 102 детей группы сравнения. При использовании закона генетического равновесия Харди–Вайнберга у детей с СССУ было получено 106 аллелей, в группе сравнения — 204.

По результатам полимеразной цепной реакции выявлены 3 вида генотипов eNOS у больных СССУ и лиц группы сравнения: 4a/4а — гомозиготный по аллелю с 4-мя повторами, 4a/4b — гетерозиготный, 4b/4b — по аллелю с 5-ю повторами.

Анализ полученных данных установил, что частота встречаемости носителей аллеля 4a гена eNOS среди детей с СССУ составила 82,1 ± 3,7%, статистически значимо превышая величину аналогичного показателя у здоровых сверстников — 69,6 ± 3,2% (ОШ = 2,00; 95% ДИ ОШ = 1,082–3,723; р = 0,026). Частоты распространения носителей аллеля 4b гена eNOS распределялись следующим образом: дети с СССУ — 17,9 ± 3,7%, у детей группы сравнения — 30,4 ± 3,2% (табл.).

Частота носителей гомозиготного дикого генотипа 4a/4а среди детей с СССУ составила 66,0 ± 6,5% и была статистически значимо выше, чем у детей группы сравнения — 46,1 ± 4,9% (р = 0,029). Величина отношения шансов составила 2,28, указывая на высокую степень влияния генотипа 4а/4а на риск развития патологии проводящей системы у детей.

Частоты гомозиготного генотипа 4b/4b и гетерозиготного генотипа 4a/4b были примерно одинаковыми у детей обследуемых групп. Так, частота гетерозиготного генотипа 4a/4b у детей с СССУ составила 32,1 ± 6,4%, в группе контроля — 47,0 ± 4,9% (р = 0,212). Частота гомозиготного мутантного генотипа 4b/4b у детей с СССУ — 1,9 ± 1,9%, в группе сравнения — 6,9 ± 2,5% (р = 0,345) (рис.).

Таким образом, у детей с идиопатическим СССУ установлено достоверное преобладание гомозиготного генотипа 4а/4a гена eNOS по сравнению c лицами контрольной группы, что указывает на высокую вероятность развития аритмий, важного критерия синдрома слабости синусового узла.

Заключение

Проведенное исследование свидетельствует, что изученный генетический маркер может быть использован для выявления предрасположенности к наследственному синдрому слабости синусового узла, подтверждения диагноза и обоснования оперативной тактики ведения больных с целью профилактики неблагоприятных исходов.

Литература

1. Massion P. B., Feron O., Dessy C. et al. Nitric oxide and cardiac function: ten years after, and continuing // Circ. Res. 2003; 93: 388–398.
2. Fischmann T. O., Hruza A., Niu X. D. et al. Structural characterization of nitric oxide synthase isoforms reveals striking active-site conservation // Nat. Struct. Biol. 1999; 6 (3): 233–42.
3. Wang X. L., Mahaney M. C., Sim A. S. et al. Genetic contribution of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene to plasma nitric oxide levels // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1997; 17: 3147–3153.
4. Ziolo M. T., Bers D. M. The real estate of NOS signaling: location, location, location // Circ. Res. 2003; 92: 1279–1281.
5. Charles I. G., Palmer R. M., Hickery M. S. et al. Cloning, characterization and expression of a cDNA encoding an inducible nitric oxide synthase from the human chondrocyte // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 11419–11423.
6. Forstermann U., Closs E. I., Pollock J. S. et al. Nitric oxide synthase isozymes: characterization, purification, molecular cloning, and functions // Hypertension. 1994; 23: 1121–1131.
7. Forstermann U., Munzel T. Endothelial Nitric Oxide Synthase in Vascular Disease: From Marvel to Menace // Circulation. 2006; 113: 1708–1714.
8. Wang H., Kohr M. J., Wheeler D. G. et al. Endothelial nitric oxide synthase decreases β-adrenergic responsiveness via inhibition of the L-type Ca2+ current // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2008; 294: 1473–1480.
9. Veldman B. A., Spiering W., Doevendans P. A. et al. The Glu298 Asp polymorphisms of the NOS3 gene as a determinant of the baseline production of nitric oxide // J. Hypertens. 2002; 20: 2023–2027.
10. Nakayama M., Yasue H., Yoshimura M. et al. T-786 C mutation in the 5′-flanking region of the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm // Circulation. 1999; 99: 2864–2870.
11. Fatini C., Sofi F., Sticchi E. et al. Influence of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms (G894T, 4a4b, T-786 C) and hyperhomocysteinemia on the predisposition to acute coronary syndromes // Am. Heart. 2004; 147: 516–521.
12. Tong Y., Yin X., Wang Z. et al. A tailed primers protocol to identify the association of eNOS gene variable number of tandem repeats polymorphism with ischemic stroke in Chinese Han population by capillary electrophoresis // Gene. 2013; 517 (2): 218–223.
13. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory. Cold Spring Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
14. Smith C. L., Kalco S. R. Cantor C. R. Pulsed field gel electrophoresis and the technology of large DNA molecules. In: Davis R. E., Ed. Genome analysis. Washington: IRL Press; 1988.
15. Zhang R., Min W., Sessa W. C. Functional analysis of the human endothelial nitric oxide synthase promoter. Sp1 and GATA factors are necessary for basal transcription in endothelial cells // J. Biol. Chem. 1995; 270: 15320–15326.

Статья опубликована в журнале Лечащий Врач