Роль оценки циркулирующих опухолевых клеток при раке простаты: диагностика и динамическое наблюдение | Павлов А.Ю., Гафанов Р.А., Цыбульский А.Д., Фастовец С.В., Кравцов И.Б., Исаев Т.К.

Статья посвящена диагностике и динамическому наблюдению при оценки роли циркулирующих опухолевых клеток при раке простаты

Для цитирования. Павлов А.Ю., Гафанов Р.А., Цыбульский А.Д. и др. Роль оценки циркулирующих опухолевых клеток при раке простаты: диагностика и динамическое наблюдение // РМЖ. 2016. No 8. С. 480–487.

     Введение
     Рак предстательной железы является наиболее распространенным злокачественным новообразованием и вторым по причине смерти от рака у мужчин в США. Радикальная простатэктомия и дистанционная лучевая терапия проводятся мужчинам с локализованным и местно-распространенным РПЖ, а андроген-депривационная терапия (АДТ) представляет собой одну из составляющих в лечении местно-распространенного, рецидивирующего или метастатического РПЖ [1]. Хотя кастрационная терапия эффективна у большинства пациентов, почти у всех мужчин в конечном итоге заболевание прогрессирует до развития кастрационно-резистентного РПЖ (КРРПЖ). Последние исследования показывают, что даже при кастрационном уровне тестостерона КРРПЖ зависит от андрогенных рецепторов (АР) [2]. Это привело к разработке эффективных лекарственных препаратов абиратерона и энзалутамида, которые воздействуют на андрогенную ось регуляции [3−6]. Некоторые пациенты при метастатическом КРРПЖ получают цитостатики таксанового ряда (доцетаксел, кабазитаксел). У большинства из них лечение сопровождается положительным клиническим ответом [7−9]. Таким образом, можно отметить, что за последние 10 лет появились новые лекарственные методы лечения для мужчин с КРРПЖ, которые позволили значительно улучшить показатели выживаемости. Тем не менее в настоящее время нет биомаркеров, которые бы позволили предсказать ответ на проводимую терапию. Специфический биомаркер простат-специфический антиген (ПСА) может лишь констатировать эффективность проведенного лечения, но не позволяет прогностически оценить клиническую пользу от проводимой терапии [10−13].
     Одновременно с увеличением количества доступных методов лечения появилось определенное понимание молекулярных аномалий, которые приводят к развитию и прогрессированию РПЖ. Вместе с тем молекулярные причины, по которым пациенты по-разному реагируют на лечение, а в некоторых случаях вовсе не дают ответа на специфическую терапию, остаются неясными. В частности, отсутствие ткани предстательной железы для анализа до и вовремя лечения, а также в момент рецидива значительно затрудняет возможность оценить механизмы реагирования и резистентности к лечению. В последнее время ряд исследователей начали выполнять биопсию метастатических поражений до и после терапии, но это не входит в рамки протоколов и является проблематичным.
     Методика определения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) была разработана для решения проблем у пациентов с различными солидными опухолями, в том числе РПЖ, даже в тех случаях, когда нет опухолевой ткани для морфологической или молекулярной верификации. ЦОК, выделенные из периферической крови больных раком, могут представлять собой объективный и легкодоступный источник опухолевой ткани в виде «жидкой биопсии». Однако клиническое использование этой клеточной популяции ограничено малым количеством жизнеспособных ЦОК в периферической крови (1 ЦОК/1×106-9 кровяных клеток). Сегодня технология CellSearch для определения ЦОК (Jansenn Diagnostics) остается единственным зарегистрированным FDA-методом, позволяющим выделять из периферической крови больных раком и пересчитывать ЦОК. Опухолевые клетки захватываются путем эпителиальной клеточной адгезии (Epithelial Cell Adhesion Molecule − ЕрСАМ) способом иммуномагнитной сепарации. Наличие в крови ЦОК – это неблагоприятный признак злокачественного заболевания [14]. Несколько исследований показали, что EpCAM на основе иммунологического захвата идентифицирует субпопуляции ЦОК только в связи с их высокой молекулярной неоднородностью [15]. В этом обзоре мы опишем клиническую значимость ЦОК как средства диагностики, скрининга и прогноза в развитии РПЖ.

     Методы выделения ЦОК при РПЖ
     В настоящее время огромные усилия сосредоточены на оптимизации технических аспектов выделения и оценки ЦОК из периферийной крови больных раком. Эти усилия в основном направлены на уменьшение качественных и количественных ошибок в подсчете ЦОК, а также минимизацию потери ЦОК, вызванной избыточным забором крови во время обработки. Большинство доступных подходов для захвата ЦОК основаны на их  отличии от нормальных клеточных компонентов крови по  физическим  (размер, плотность, разность потенциалов) и молекулярным  (например, поверхностная экспрессия) характеристикам. 

     Выделение ЦОК при РПЖ на основе физических свойств
     Физические методы выделения ЦОК основываются на особенностях размера, плотности, мембранной емкости, которые отличают ЦОК от других клеток в кровотоке. Однако феномен эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), при котором происходят морфологические трансформации, проявляющиеся изменением размера и формы клеток, наблюдаются плеоморфизм клеток и ядер, гиперхромазия и гиперплоидность, а также отмечается увеличение их митотической активности,  оказывает влияние на формирование гетерогенности ЦОК, а также обусловливает технические трудности их обнаружения и фенотипирования. Одним из наиболее часто используемых методов физического разделения является разделение по градиенту плотности при помощи центрифугирования. С помощью градиента плотности Ficoll-Paque® (GE Healthcare Life Sciences; OncoQuick®, Greiner bio-one) клетки крови и ЦОК делятся на различные слои (плазма, клетки и мононуклеарные тела, ануклеатидные клетки). За счет отличительных особенностей размера и формы ЦОК отделяются от мононуклеарных клеток (мононуклеарные клетки периферической крови [МКПК]). Отсортированные ЦОК впоследствии могут быть идентифицированы с помощью обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции или иммунофлуоресценции. При таком подходе ЦОК были выявлены у 79% пациентов с РПЖ [16]. Однако основным недостатком этого подхода является низкая чистота конечного образца − отчасти из-за кросс-контаминации между различными слоями клеток [17]. При другом способе, основанном на физических свойствах, используются микрофильтрационные устройства, в которых ЦОК выделяются за счет размера [18, 19]. Диаметр и площадь опухолевых клеток (15−25 мкм и 396−796 мкм2 соответственно), больше, чем у МКПК (менее 12 мкм и 140 мкм2 соответственно) [20]. Один из способов выделения ЦОК при РПЖ − технология ISET® (метод выделения по размерам эпителиальных опухолевых клеток, Rare cells Diagnostics), при которой путем пропускания цельной крови через фильтр с порами 8 мкм в диаметре выделяются ЦОК, задерживаясь на фильтре. В одном исследовании методика ISET оказалась эффективным способом выделения ЦОК из периферической крови больных РПЖ с чистотой обнаружения выше, чем при использовании CellSearch® (75 против 60%) [21]. Основной недостаток этого подхода − неспособность захватывать небольшие ЦОК – делает затруднительным клиническое применение этого метода. ЦОК у больных РПЖ весьма неоднородны, в некоторых случаях меньше ожидаемого размера, при этом иные метастатические ЦОК при РПЖ демонстрируют площадь поперечного сечения 89 мкм2, что сравнимо с лейкоцитами [22].
     Размер также является ключевой характеристикой при анализе ЦОК в высоком разрешении, в котором после лизиса эритроцитов ядра клеток помещаются на стеклянные слайды для стандартного иммунофлуоресцентного окрашивания в целях детального морфологического анализа. Этот метод в состоянии идентифицировать ЦОК в 80% при метастатическом РПЖ в виде отдельных клеток или кластеров ЦОК [23−25]. Захват и выделение ЦОК из циркулирующих лейкоцитов основан на электрических свойствах [26–28]. Диэлектрофорез широко используется для выделения раковых клеток из периферийной крови [29, 30]. Применяя внешние электрические поля при выделении раковых клеток методом диэлектрофореза, можно свести к минимуму наличие лейкоцитов в образце [31]. Предварительные отчеты по определению ЦОК при РПЖ указывают на высокую чувствительность этой технологии (76−83%) и поразительную специфичность (74−82%) [32]. Однако этот метод все еще нуждается в дальнейших клинических исследованиях.

     Выделение ЦОК при РПЖ на основе биологических свойств
     Методы изоляции ЦОК, основанные на их биологических свойствах, как правило, связаны с экспрессией опухолеспецифичных маркеров за счет взаимодействия антиген-антитело. Антитело (или группа антител) идентифицирует один или несколько антигенов, экспрессируемых либо плазматической мембраной раковых клеток (положительный выбор), либо лейкоцитами (отрицательный выбор), что придает специфичность и чувствительность этой методике. После обогащения ЦОК могут быть визуально обнаружены иммуноокрашиванием для эпителиальных клеток (цитокератин) и лейкоцитов (CD–45). Негативный отбор ЦОК опирается на уменьшение лейкоцитов крови с помощью моноклональных антител, направленных на антигены (обычно CD-45). 
     Многие исследователи при определении ЦОК в крови использовали систему CellSearch (Veridex) [32], которая получила одобрение Управления по контролю за продуктами питания и медицинскими изделиями (Food and Drug Administration, FDA) США для выявления уровней ЦОК у пациентов с метастазами, но не для клинического использования. Система является полуавтоматической, в ее основе лежат методы иммунофлуоресценции, иммуномагнитного разделения и проточной цитометрии [33]. При использовании данной технологии образец крови помещается в системный комплекс, где происходит его обработка магнитными частицами, покрытыми антителами против эпителиальных молекул клеточной адгезии (EpCAM), и флуоресцентной меткой, например, зеленого цвета. Затем происходит обработка флуоресцентно-меченными антителами против лейкоцитов (CD45-аллофикоциан), например, красного цвета. В результате реакции опухолевые клетки взаимодействуют с антителами с магнитными частицами с зеленой меткой, а лейкоциты взаимодействуют с антителами против них с красной меткой. Далее, под воздействием магнитного поля опухолевые клетки прижимаются к поверхности, и автоматический сканер (на двух длинах волн) считывает количество клеток, автоматически проверяя, не является ли данная клетка лейкоцитом. Таким образом, система позволяет не только отделить лейкоциты от раковых эпителиальных клеток, но и подсчитать последние. Предел чувствительности данной системы составил 5 и более ЦОК на 7,5 мл крови [32, 34–37]. Подобный принцип работы реализован еще в одной системе − Ariol [38].
     Подобно CellSearch®, MagSweeper выделяет ЦОК через EpCAM с применением иммуномагнитного метода. Cann et all. показали, что этот метод достиг эффективности 63±25% с чистотой изолированной популяции клеток 10±6% при испытании с клетками больных РПЖ [39]. 
     Дальнейшее развитие методики привело к разработке устройства ЦОК-iChip, основанного на микропроточной системе. При этом захват опухолевых клеток из гетерогенной клеточной популяции происходит путем специфического связывания с субстрат-иммобилизованными высокоаффинными лигандами. Через чип прокачивается кровь в строго определенных условиях ламинарного течения. Чувствительность метода высокая (99%), и технология позволяет проводить анализ достаточно малых объемов крови (2−3 мл). Nagrath et al. [40] протестировали данную методику у пациентов с РПЖ и смогли выделить клетки опухоли в 100% случаев со средней чистотой 49%. Stott et all. [41] оценивали этот метод и сообщили, что эффективность улавливания составила 91%, ЦОК выявлены у 93% больных с чистотой 14%. Использование этого устройства, простой молекулярный анализ ЦОК, определение уровня ПСА и экспрессии простат-специфического мембранного антигена (PSMA) должны предшествовать лечению абиратероном и быть прогностическими при исследовании в небольшой группе пациентов [35]. Дальнейшее развитие метода привело к появлению ЦОК-iChip – микропроточных устройств, использующих несколько степеней инерциальной фокусировки и магнитной сепарации, с целью выделения жизнеспособных ЦОК. Этот подход продемонстрировал высокую эффективность в выделении раковых клеток с чрезвычайно разным уровнем экспрессии ЕрСАМ, доказывая независимые от каких-либо эпителиально-мезенхимальных трансформаций (ЭМТ) молекулярные изменения. Ozkumur et al. [42] показали, что эта платформа может определить ЦОК у 90% пациентов с РПЖ со средней чистотой 7,8%.
     В микрофлюидных устройствах зачастую используют PDMS-каналы, на поверхности которых иммобилизованы белковые антитела или аптамеры. Технология применения такого типа микрофлюидных устройств позволяет с очень большой вероятностью выделять из крови онкобольных ЦОК [43, 44]. Таким образом, методы, основанные на физических свойствах, включают: фильтрацию через специальные фильтры или новый гибкий микрочип без метки, в котором используется уникальное различие в размере и деформируемости опухолевых клеток (больше размером и менее гибкие, чем клетки крови); микропроточное устройство, в котором комбинируются разделение при прохождении через множество отверстий и технология разделения клеток с помощью диэлектрофореза; устройство для фракционирования с помощью проточно-полевого диэлектрофореза, которое позволяет изолировать жизнеспособные ЦОК по отличию их реакции на диэлектрофорез вследствие их различий по размеру и свойствам мембраны. Фильтрация, основанная на размере клеток, удобна, но ее эффективность ограничена, поскольку на мембране остается много лейкоцитов, а более мелкие ЦОК проходят через нее. Это ограничение обусловлено широким диапазоном размеров ЦОК (от 4 до 30 мкм) даже у одного и того же пациента. В исследовании Kirbi et all. [45] с помощью устройства PSMA-GEDI захватывали раковые клетки в 1 мл цельной крови и использовали их для молекулярной характеристики. Исследователи смогли извлечь РНК из захваченных клеток и проанализировали их на наличие точечных мутаций АР, а также для оценки экспресии TMPRSS2-ERG, соединенного с белком, при иммунофлуоресценции.
     Количество крови, обрабатываемое с помощью каждого из этих устройств, различно и колеблется от 1 мл (чип GEDI) до 10 мл (ЦОК-iChip). Эта характеристика может иметь значение в клинической практике, особенно когда устройство используется для выполнения различных анализов. Напротив, Hb-чип выгоден за счет прозрачного пластика, что гарантирует возможность выполнения патологической оценки захваченных ЦОК с помощью обработки гематоксилином/эозином, тем самым увеличивая достоверность идентификации реальных ЦОК в анализируемом образце [46]. К сожалению, прямое сравнение различных микропроточных устройств в литературе не приведено, поэтому не представляется возможным определить клиническое превосходство одного над другим.
     Проточная цитометрия была также использована для идентификации ЦОК у пациентов с РПЖ [47]. При использовании флуоресцентных меченых антител PSMA Wu et al. [48] удалось обнаружить раковые клетки в периферической крови. Danila et al. [49] в клиническом исследовании выделяли ЦОК с помощью флуоресцентной активации клеток (FACS) и анализировали с помощью RT-PCR. Оценивалась экспрессия нескольких важных факторов, таких как АР, ПСА и TMPRSS2-ERG, соединенных с белком. Клеточная адгезия на кровеносные сосуды разрабатывается в качестве биологического подхода в выделении ЦОК при РПЖ. С помощью этого метода Gakhar et al. [50] выделили ЦОК у 23 из 27 пациентов с РПЖ, в то время как Hughes et al. [51] обнаружили ЦОК у 14 из 14 обследованных больных РПЖ, с чистотой 66%.
     Используя способность жизнеспособных опухолевых клеток секретировать белки, такие как муцин, было предложено для выявления и точного подсчета ЦОК у пациентов с солидными опухолями в качестве альтернативных применять методы ELISPOT (энзим-связанное определение) и EPISPOT (эпителиальное иммунологическое определение) [52, 53]. После ступенчатого центрифугирования мононуклеарные клетки инкубируют на мембране, покрытой анти-ПСА, а секреция ПСА обнаруживается через второе флуоресцентно-маркированное анти-ПСА антитело. Alix-Panabieres et al. [54] использовали пробу EPISPOT ПСА-секретирующих ЦОК у 24 мужчин с метастатическим РПЖ и были в состоянии идентифицировать опухолевые клетки у 20 (83%) из них. Та же группа подтвердила эти результаты при втором анализе, где муцин-1 секретирующие ЦОК и ПСА-секретирующие ЦОК были выявлены у 83 и 65% пациентов соответственно [55].

     Роль ЦОК в клинической практике

     ЦОК в диагностике РПЖ
     Скрининг РПЖ позволяет выявлять и лечить злокачественный процесс на ранних стадиях, что приводит к повышению выживаемости и снижению смертности от РПЖ. В настоящее время для скрининга применяется пальцевое ректальное исследование (ПРИ) и измерение уровней ПСА сыворотки крови [56−58]. Несмотря на широкое использование в проспективных рандомизированных исследованиях, до сих пор сомнительна фактическая польза уровня ПСА как скринингового биомаркера [59−61]. РПЖ характеризуется клинической гетерогенностью. У большинства пациентов болезнь протекает бессимптомно, у другой части характерно агрессивное течение с быстрой прогрессией. Следовательно, программы скрининга, которые могут определить субпопуляцию пациентов с высоким риском развития агрессивного РПЖ, могут значительно улучшить выживаемость [62].
     Последние достижения в исследованиях диагностического потенциала ЦОК могут обеспечить более чувствительные и надежные методики выявления заболеваний на ранних стадиях и определять степень злокачественности с последующим интегрированием в программы скрининга РПЖ. Allard et аl. [38] использовали CellSearch® для количественной оценки ЦОК у здоровых субъектов и пациентов с доброкачественными или неопухолевыми заболеваниями у которых диагностированы метастазы. Они отметили, что 1 ЦОК в 7,5 мл периферической крови была обнаружена лишь у 5,5% пациентов в здоровой популяции и у 7,5% пациентов с доброкачественными или неопухолевыми заболеваниями предстательной железы. Соответственно среднее значение ЦОК составило 0,1/7,5 мл крови, что значительно ниже принятого порога 5 ЦОК/7,5 мл, характерного для больных метастатическим РПЖ. Тем не менее спорные выводы касаются чувствительности ЦОК. Так, анализ ЦОК, выполненный методом CellSearch®,не обнаружил разницы между образцами крови больных местно-распространенным РПЖ и когорты здоровых людей [63]. В противоположность этому Stott et al. [64] обнаружили ЦОК в 42% случаев локализованного РПЖ с помощью ЦОК-чипа микрожидкостного устройства. Murray et al. [65, 66] исследовали потенциальную роль ЦОК при РПЖ в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний по сравнению с незлокачественными у лиц, перенесших биопсию простаты. Авторы использовали экспрессию P504S как маркера РПЖ и отметили, что PSA/P504S-клетки присутствовали в периферической крови и это коррелировало с доброкачественным заболеванием [65, 66]. Хотя такие выводы оптимистичны, свойства этого маркера требуют более глубокого изучения в последующих клинических исследованиях с целью оценки его потенциальной полезности.
     В целом идентификация ЦОК на ранних стадиях РПЖ достижима, и более чувствительные и специфичные методы должны широко применяться в этой клинической ситуации. Таким образом, включение определения ЦОК в программу скрининга для выявления РПЖ наряду с действующими процедурами очень привлекательно, хотя преждевременно говорить о перспективах, поскольку эта стратегия заслуживает дальнейшего изучения. Еще одна потенциальная польза обнаружения ЦОК – это ранняя диагностика метастазов у больных PПЖ. Обнаружение ЦОК может быть предвестником метастатического прогрессирования и позволит быстро начать лечение, прежде чем метастатические очаги будут обнаружены при стандартном радиологическом обследовании. ЦОК были обнаружены в периферической крови пациентов с локализованным и местно-распространенным РПЖ без клинических признаков метастатического поражения. Можно предположить, что эти клетки могут выступать в качестве субстрата в развитии метастазов [67]. Кроме того, присутствие опухолевых клеток в костном мозге (диссеминированные опухолевые клетки) у пациентов с неметастатическим РПЖ коррелирует с более высокой частотой ПСА-рецидивов [68]. Наличие ЦОК и диссеминированных опухолевых клеток после проведения лечения локализованного РПЖ можно считать остаточной болезнью, и такое состояние часто приводит к снижению показателей безрецидивной выживаемости [68]. Alix-Panabieres et al. [55] обнаружили ЦОК у пациентов с локализованным РПЖ, при этом отметив, что подмножество из этих идентифицированных опухолевых клеток характеризовалось секрецией FGF2, подчеркивая их метастатический потенциал. Тем не менее нет корреляции между этими выводами и фактическим метастатическим прогрессированием в анализируемой когорте пациентов. Интересно, что Nagrath et al. [40] сообщили об аналогичных ЦОК при местно-распространенном или метастатическом РПЖ, предполагая, что клиническое применение ЦОК может быть ограниченно.

     Роль ЦОК в прогнозе кастрационно-резистентного РПЖ (КРРПЖ)
     Обнаружение ЦОК в периферической крови больных РПЖ само по себе не характеризует клинические особенности течения заболевания и его ответ на лечение. В ранних клинических исследованиях изучалась клиническая значимость ЦОК как прогностического маркера прогрессирования заболевания. Сообщалось о большом количестве ЦОК, выделенных FDA-методом, при прогрессировании РПЖ [14, 69, 70]. Большое содержание ЦОК связано с неблагоприятным прогнозом. Когда различные пороговые значения оценены, прогностическая значимость повышается. В большинстве исследований при РПЖ с использованием CellSearch® диагностический порог составлял 5 ЦОК/7,5 мл крови и ниже [37, 71, 72]. Важно отметить, что количество ЦОК коррелирует с клиническим исходом независимо от других предикторов и превосходит ПСА в прогнозировании течения РПЖ. Прогностическая значимость ЦОК важна не только для оценки онкологического статуса в момент исследования, но и для оценки благоприятных и неблагоприятных исходов (от >5 до <5 ЦОК/7,5 мл), а также для оценки эффективности лечения путем сравнения начальной и последующей численности ЦОК (снижение >50% или увеличение >30%) [36, 71, 73]. Большее число ЦОК обнаруживается обычно у больных РПЖ с метастатическим поражением костей [74]. Связь объема ЦОК и прогноза заболевания привело к одобрению FDA теста CellSearch® в качестве индикатора для мониторинга пациентов с РПЖ [75]. 
     Vaishampayan et al. [76] исследовали потенциальную роль ЦОК в качестве альтернативы конечной точки выживаемости у пациентов с КРРПЖ, получавших комбинацию бевацизумаба с сатраплатином во II фазе клинического исследования. CellSearch® оценивали после окончания терапии. Объем ЦОК >5 прогностически неблагоприятен и указывает на прогрессирование заболевания. К сожалению, определение ЦОК вынужденно проводилось уже после лечения, при отсутствии  исходных данных. Кроме того, оценка ЦОК была возможна только у 17 пациентов (7 с ЦОК <5 и 10 с ЦОК >5) из 31, принявших участие в клиническом исследовании. Это ограничивало клиническое применение результатов. Armstrong et al. [77] использовали оценку ЦОК в качестве первичной конечной точки для оценки клинической эффективности ингибитора mTOR − темсиролимуса у пациентов, которые ранее получали лечение по поводу КРРПЖ. Авторы рассчитывали ЦОК с помощью CellSearch® до и через 8 нед. после начала лечения и обнаружили, что у 73% пациентов отсутствовали какие-либо изменения. Этот результат − «отсутствие противоопухолевой активности» − отмечали также по ПСА и радиологическим данным [77]. Однако даже в этом случае весьма скромное количество пациентов (11) не позволило сравнить точки выживаемости между пациентами с ответом и без ответа по показателю ЦОК. Lee et al. [78] провели I фазу исследования МЕТ/сосудистого рецептора фактора роста эндотелия VEGFR-2, ингибитора кабозантиниба при КРРПЖ и оценку объема ЦОК в качестве маркера для мониторинга клинической эффективности, а также вторичной точки. Объем ЦОК оценивался каждые 3 нед. после 15 нед. лечения. У 11 пациентов из 12 с исходным неблагоприятным прогнозом выявлено снижение ЦОК на 30%, а у 58% пациентов неблагоприятный прогноз поменялся на благоприятный. Пациенты с изменившимся прогнозом продемонстрировали наиболее высокий процент положительных клинических ответов с более длительной медианой наблюдения. Полученные результаты убедительно свидетельствуют о прогностической роли оценки объема ЦОК. Shamash et al. [79], оценивая клиническую пользу высоких доз алкилирующего агента мелфалана у пациентов с КРРПЖ, обнаружили у пациентов с ЦОК <5/7,5 мл крови значительное преимущество в общей выживаемости (30,6 против 15,3 мес.; р=0,03). Очень интересно, что изменение объема ЦОК произошло в течение 2-х недель от начала терапии и быстрее, чем снижение уровня ПСА. Совсем недавно Goldkorn et al. [80] проанализировали прогностическое значение объема ЦОК у 212 пациентов с КРРПЖ, получающих лечение доцетакселом в III фазе клинического исследования SWOG S0421. Авторы показали, что неблагоприятные цифры ЦОК коррелируют с более короткой медианой общей выживаемости (р<0,001). Кроме того, рост числа ЦОК только после одного цикла химиотерапии был связан со значительным ухудшением общей выживаемости. Представленные данные показательны, т. к. изменения объема ЦОК может привести к ранним изменениям в стратегии лечения. В целом эти результаты перспективны и подчеркивают прогностическую роль ЦОК у пациентов с КРРПЖ. 
     Sher et al. [81] оценили противоопухолевую активность антагониста АР энзалутамида в I−II фазе клинического исследования, отслеживая уровень ЦОК до и во время лечения. Авторы отметили, что изменение количества ЦОК с неблагоприятного на благоприятное в процессе лечения в 75% случаев не коррелировал со снижением уровня ПСА. Anand et al. [82] оценивали число ЦОК при КРРПЖ после прогрессии на фоне химиотерапии у пациентов, которым проводилось лечение энзалутамидом. Было отмечено, что количество ЦОК на 12-й неделе лечения явилось значимым предиктором наступления радиологической прогрессии. Raid et al. [83] проанализировали роль ЦОК в качестве маркера ответа на лечение во II фазе клинического исследования, оценивающего ингибитор синтеза андрогенов абиратерон при КРРПЖ у пациентов которые ранее получали доцетаксел. Авторы наблюдали снижение ЦОК <5/7,5 мл у 41% пациентов и значительную корреляцию между снижением ЦОК и снижением уровня ПСА. Тем не менее значительная корреляция между числом ЦОК и традиционными маркерами ответа не наблюдалась. Sher et al. [84] оценили потенциальную роль ЦОК в качестве биомаркеров интеллектуального ответа после лечения абиратероном в III фазе клинического исследования COU-AA-301. Авторы оценивали ЦОК после 12 нед. лечения и сообщили, что у пациентов с ЦОК <5/7,5 мл в сочетании с нормальным уровнем лактатдегидрогеназы была отмечена 2–летняя выживаемость в 46% случаев в сравнении с 2% для пациентов с ЦОК >5 и высоким уровнем лактатдегидрогеназы. Одно из ограничений описанных выше исследований связано с CellSearch®. Эта технология не может обнаружить фракцию EpCAM-негативных клеток, возможно, это связано с реакцией опухоли на прогрессирование заболевания и проводимую терапию. Оценка числа ЦОК может быть более содержательна, если использовать альтернативные технологии для выделения клеток, которые должны основываться не только на ЕpCAM. Yu et al. [15] сообщили, что ЦОК могут быть как эпителиальными, так и мезенхимальными при метастатическом раке молочной железы, а количественные колебания каждой конкретной подгруппы коррелирует с ответом на лечение. ЦОК содержат мезенхимальный молекулярный профиль, связанный с прогрессированием заболевания. Таким образом, наличие и клиническое значение ЦОК с характеристиками ЭМП при РПЖ должны быть хорошо изучены. В литературе представлены некоторые доказательства, которые подтверждают наличие этого варианта ЦОК у субпопуляции пациентов с РПЖ. Armstrong et al. [85] показали, что ЦОК с мезенхимальными стволовыми клетками могут быть выделены у 100% пациентов с КРРПЖ и у 84% возможна верификация ЦОК с эпителиальными и мезенхимальными маркерами. Однако авторы использовали CellSearch® для выделения ЦОК, и их анализ, а также основа ЕрСАМ могут значительно ограничить оценку, которая связана со снижением идентификации мезенхимальных фракций ЦОК. Кроме того, Chen et al. [86] показали, что ЦОК, выделенные у пациентов с КРРПЖ и связанные с ЭМТ, характеризуются существенно большей концентрацией, чем у кастрационно-наивных пациентов. Тем не менее проанализированные данные малы, и только незначительная часть выделенных ЦОК впоследствии оцениваются на ЭМП, связанных с генным профилем. Несмотря на это, оценка мезенхимальной субпопуляии ЦОК при РПЖ по-прежнему не выяснена.

     ЦОК в молекулярной оценке биологической характеристики заболевания
     Обнаружение и фенотипирование ЦОК на сегодняшний день считается наиболее перспективным направлением «жидкой биопсии» – исследования периферической крови онкологического больного. ЦОК могут быть использованы в качестве прогностических и предиктивных биомаркеров, а также с целью скрининга, выявления минимальной остаточной опухолевой болезни и для мониторинга заболевания.

     Андрогенные рецепторы 
     Сигнальная ось регуляции андрогенов является одним из основных механизмом в развитии и прогрессировании РПЖ, особенно при развитии КРРПЖ [2]. Следовательно, АР являются конечной целью некоторых препаратов (например, абиратерон и энзалутамид). Мониторинг уровня экспрессии АР, мутации и сигнальной активности поможет точнее отобрать пациентов для АР-целевой терапии и определения молекулярной эффективности лечебного препарата. ЦОК − уникальный материал для исследования результатов применяемого лечения как с функциональной, так и биологической точки зрения. 
     В первой попытке изучить АР в ЦОК Shaffer et al. [87] оценивали число копий АР гена с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) при КРРПЖ с помощью системы CellSearch® и зарегистрировали увеличение АР у 56% (5/9) пациентов с ЦОК >5/7,5 мл крови. Точно так же Leversha et al. [88] обнаружили увеличение АР методом CellSearch® у 30 из 49 больных РПЖ. В целом эти результаты доказали возможность анализа АР в ЦОК [89]. Биологическая роль увеличения АР в ЦОК, его корреляция со статусом АР в первичной опухоли и с ответом на лечение антиандрогенами все еще ждут клинической оценки. Недавно Miyamoto et al. [35] проанализировали характеристики АР в ЦОК, выделенных у больных РПЖ, с помощью EpCAM-чипа. Они обнаружили, что при высокой активности АР у нелеченых пациентов АДТ неэффективна, и она может быть возобновлена на момент прогрессирования КРРПЖ, когда наблюдается высокая неоднородность АР. Это говорит о том, что другие пути, кроме АР-реактивации, могут также способствовать прогрессированию РПЖ. Эти результаты подтверждают важность ЦОК как динамического маркера опухоли, который может отражать в реальном времени эффекты проводимой терапии. В связи с этим Tagawa et al. [90] включили пациентов с РПЖ, принимающих препараты таксанового ряда, во II фазу проспективного рандомизированного исследования (TAXYNERGY, NCT01718353). Как ранее было показано, АР используют микротрубочки (МТ) для движения в ядро клетки. Его сигналы нарушают МТ-таргетные препараты, такие как доцетаксел, которые поддерживают АР в цитоплазме в неактивном состоянии [91−93]. Darshan et al. [92] в небольшом пилотном проекте показали значительную корреляцию между АР в ЦОК и клиническим ответом на таксаны у пациентов с КРРПЖ. Кроме того, недавние исследования обнаружили, что экспрессия клинически значимых АР вариантов сплайсинга AR-v7, у которых отсутствует лигандсвязывающий и МТ-связывающий домен, придает устойчивость к таксанам как in vitro, так и in vivo [94]. В исследовании TAXYNERGY для оценки эффективности лечения таксанами проводилось выделение ЦОК для анализа АР. Молекулярный ответ ЦОК на лечение коррелировал с клиническим эффектом. Кроме того, из выделенных ЦОК была получена РНК для характеристики АР и проанализирована клиническая роль вариантов АР в начальной устойчивости к таксанам. По завершении исследования полученные в нем данные должны будут дать важную информацию о клинической роли АР при лечении таксанами. 

     Ген ERG
     Особенностью опухолевых образований, является способность к формированию химерных генов, то есть разных генов, объединенных в один. На сегодня обнаружены такие характерные сочетания практически во всех опухолях. При раке предстательной железы образуется такой химерный вариант TMPRSS2/ERG4, обнаружить который можно при обследовании биоптата органа в генетической лаборатории.
     Ген TMPRSS2 регулируется гормоном андрогеном, в нем есть не транслируемый участок 5I области, который в патологическом процессе соединяется с участками (экзоном) генов из семейства ETC, в частности ETC4. Части соединенных генов при этом утрачиваются, и этот процесс называют делецией. После чего не остается участков, естественным образом прекращающих транскрипцию. Это ведет к беспрерывному считыванию информации и усилению скорости формирования белков. Первый ген из химерной комбинации кодирует фермент сериновую протеазу, она начинает образовываться в избыточном количестве, обеспечивая безудержный рост и агрессивность опухоли, образование ею метостазов [95–98]. Atterd G. et al. [89] выделяли ЦОК у пациентов с КРРПЖ, используя CellSearch®, чтобы исследовать взаимосвязь между ERG, АР и геном PTEN на фоне лечения абиратероном. Отмечена значительная корреляция между ERG-перегруппировкой в ЦОК и снижением уровня ПСА при лечении абиратероном. Авторы сообщили, что ЦОК могут быть использованы для идентификации молекулярных биомаркеров и играют большую роль в выборе тактики лечения. Кроме того, ERG-перегруппировка также коррелирует с неэффективностью лечения таксановыми препаратами при КРРПЖ [99] и полезна в сочетании с другими молекулярными маркерами в диагностике и оценке РПЖ с нейроэндокринной дифференцировкой [100]. Таким образом, контролируя статус ERG в ЦОК, можно индивидуализировать лечение пациентов. Хотя эти данные обнадеживают, они являются лишь гипотезой и должны быть изучены в дальнейших исследованиях. 

     Ферментная регуляция стероидогенеза
     Активация ферментов, отвечающих за синтез активных форм внутриопухолевых андрогеновых производных, является одним из механизмов, который запускается в опухолевой клетке в ответ на АДТ [101, 102]. Последние данные показали, что ферменты стероидогенеза (например, SRD5A1, SRD5A3 и AKR1C3) и АР гиперэкспрессируются при РПЖ, в то время как экспрессия ферментов, которые инактивируют дигидротестостерон (например, SRD5A2, CYP3A4, CYP3A5, И CYP3A7), наоборот, снижается [103]. Mitsiades et al. [103] показали высокую гетерогенность пациентов с КРРПЖ в отражении этих транскриптов и предположили, что аутокринная активация андрогенной оси синтеза может произойти разными путями. Используя FACS, авторы также показали, что уровни этих ферментов могут быть оценены, в том числе в ЦОК, что позволит мониторировать потенциально возможные лечебные цели в зависимости от ферментов, которые несут ответственность за нарушение регуляции. ЦОК могут быть использованы для молекулярной оценки прогрессирования заболевания и служить ориентиром в выборе персонифицированной терапии, т. к. некоторые лекарственные препараты специально направлены на блокаду синтеза ферментов стероидогенеза у ряда больных.

     Выводы
     За последнее десятилетие исследование ЦОК доказало свою перспективность в вопросе изменения клинической практики. Многочисленные технологии были использованы для выделения и анализа ЦОК у пациентов с РПЖ. Несмотря на хорошие результаты, каждый из этих подходов имеет свои ограничения, выражающиеся в основном в трудности выделения всей субпопуляции опухолевых клеток из-за их физической и биологической разнородности. Таким образом, изыскание идеальной платформы для захвата ЦОК при РПЖ должно быть продолжено. Оценка исходов при РПЖ в зависимости от объема выделенных ЦОК постепенно внедряется в клиническую практику. Тем не менее процедура выделения и исследования ЦОК до сих пор не принята большинством клиницистов. ЦОК обладают значительным потенциалом в качестве надежного неинвазивного источника опухолевых клеток и как альтернатива биопсии. Исследование ЦОК не только дает понимание механизмов молекулярных и клеточных изменений при РПЖ у конкретного пациента, но также позволяет в режиме реального времени проводить мониторинг результатов лечения и прогнозировать возможное прогрессирование заболевания. В конечном счете ЦОК, скорее всего, обретут свое место в клинической практике и тем самым послужат увеличению выживаемости.

Поделитесь статьей в социальных сетях