Методы визуализации эксперементальной очаговой ишемии головного мозга

Крутинин М.В
Санкт-Петербург

Резюме

Изучение ишемического повреждения головного мозга является важным направлением современных медико-биологических исследований. На данный момент разработано множество моделей ишемического инсульта, а также предложены различные способы визуализации поврежденных тканей мозга. В данной работе мы подробно осветили наиболее популярный краситель 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый (ТТХ), а также указали на значимость данных исследований и проблемы ишемии в целом.

Ключевые слова: инсульт, ишемическое повреждение, срезы мозга, 2-3-5-трифенилтетразолий хлористый, окрашивание, крысы.

Введение

Ишемическая болезнь или коронарная болезнь выделена как самостоятельное заболевание ВОЗ в 1965 году в связи с большой социальной значимостью. В настоящее время данная патология широко распространена во всем мире, особенно в экологически развитых странах, что говорит о ее «эпидемии». Ежегодно в России инсульт выявляется более чем у 450 тысяч человек, то есть каждые 1,5 минуты кто-то из Россиян впервые переносят инсульт. Опасность ишемической болезни — скоропостижная смерть, которая представляет 2/3 случаев смерти от сердечно-сосудистых заболеваний[1,2].

Основная часть

Около 80% исследователей предпочитают лабораторных крыс, так как эти животные близки по строению сердечно-сосудистой системы к человеку, именно поэтому на них в первую очередь исследуются методы визуализации экспериментальной очаговой ишемии головного мозга.

Наиболее простым и распространённым методом формирования ишемии является перевязка средней мозговой артерии (далее СМА), имеющая большое количество вариаций:

-перевязка только СМА
-окклюзия СМА и общей сонной артерии (далее ОСА)
-окклюзия двух ОСА и одной СМА[3,4]

Операция должна быть минимально травматичной, снижать кровоток в поражённой артерии, возможно так же формирование ишемии и с реперфузией и без.

Важную роль отводят разным способам визуализации поврежденной области мозга. Инсульт можно выявить на срезах мозга, используя гистологические красители: самым распространенным подходом является окраска гематоксилин-эозином[5,6], применяют и различные модификации окраски по методу Ниссля[7,8]. Также существует способ импрегнации нервных тканей серебром. В некоторых работах отмечено, что такой подход позволяет зафиксировать дегенеративные процессы на более ранних стадиях патогенеза[9,10]. Альтернативным подходом может быть использование флуоресцентных красок Fluoro-Jade[11-13], однако их точный механизм действия пока неизвестен. Одним из самых простых способов визуализации поврежденной ткани на срезах мозга является ее окрашивание c помощью 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ)[14]. В живых клетках ферменты c дегидрогеназной активноcтью восстанавливают это соединение до производного формазана, который дает стабильное красное окрашивание здоровой ткани. В поврежденных областях, в которых нет функциональной активности митохондрий, окрашивания не происходит. Еще один подход основан на применении методов иммуногистохимии, которые позволяют визуализировать, например, апоптотические клетки в зоне поражения[15,16]. К неинвазивным методам региcтрации инсульта относятся магнитно-резонансная томография[17], позитронно-эмиссионная томография[18] и однофотонная эмиссионная компьютерная томография[19]. И это далеко не весь перечень подходов.

В данной статье мы рассмотрим один из самых простых способов визуализации экспериментальной очаговой ишемии c помощью 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ).

Данный метод визуализации поврежденной ткани на ранних стадиях развития патологии (5 ч с момента окклюзии сосуда) существенно зависит от типа используемой анестезии, а также от условий окрашивания ткани (температура, время). Таким образом, окрашивание ТТХ в качестве подхода для оценки объема повреждения мозга не следует проводить на ранних этапах развития ишемического инсульта, несмотря на ряд работ, утверждающих о такой возможности.

Кроме того, окрашивание ткани с помощью ТТХ не позволяет однозначно судить о жизнеспособности клеток в зоне повреждения в острой фазе развития инсульта. Данный краситель является индикатором дегидрогеназной активности митохондрий. Различные исследования подтверждают, что нарушение работы митохондрий действительно является одним из главных клеточных событий при повреждении тканей мозга вследствие ишемии[20,21]. Однако возникает вопрос об интерпретации результатов в случае промежуточного окрашивания тканей мозга. В норме в живой ткани краситель ферментативным путем восстанавливается с образованием формазана, который окрашивает ткань в красный цвет. В мертвой ткани реакции не происходит, и ткань остается белой. Однако в экспериментах в зоне поражения наблюдалось промежуточное розовое окрашивание, при этом интенсивность усиливалась с увеличением длительности инкубации срезов мозга в растворе красителя и при повышении температуры среды. В одной из работ была посчитана доля неповрежденных митохондрий в прокрашиваемых и не прокрашиваемых с помощью ТТХ тканях мозга. Показано, что в не прокрашиваемой зоне неповрежденными остаются около 5 % митохондрий[22]. Окрашивание ткани в промежуточный розовый цвет означает, что в этой области доля активных митохондрий значительно выше.

Известно, что при перманентной окклюзии митохондрии могут оставаться неповрежденными довольно долгое время (несколько часов или даже дней), при этом другие органеллы, например, ядро, могут быть уже разрушены[22]. При этом визуализация с помощью ТТХ в этом случае не зафиксирует повреждения ткани, что не отражает реальную картину развития патологии. При ишемии-реперфузии, которую принято считать более травматичной, повреждение митохондрий происходит быстрее. Это также необходимо учитывать при работе с определенными моделями инсульта. Кроме того, использовать ТТХ для визуализации инсульта не рекомендуется после 24 ч с момента окклюзии, поскольку в областях повреждения могут накапливаться клетки воспаления с неповрежденными митохондриями[22].

Заключение

В данной статье мы осветили большое количество методов для визуализации ишемии головного мозга: как инвазивных, так и не инвазивных. Данные эксперимента могут быть использованы в медицине, например, при подавлении болезни Альцгеймера.

Прогресс не стоит на месте, так как появляются новые методы и усовершенствуются старые. Для более точного выявления данной патологии требуется комплексное использование всех методов визуализации ишемии головного мозга.

Список литературы

1. Д. С. Билан, И. В. Кельмансон,В. В. Белоусов.Влияние типа анестезии и условий прокрашивания тканей мозга красителем 2,3,5-трифенил-тетразолием хлористым (ТТХ) на оценку ишемического повреждения мозга крыс на ранних стадиях патогенеза. Вестник РГМУ 2017. С 67-74

21. Liszczak TM, Hedley-Whyte ET, Adams JF, Han DH, Kolluri VS, Vacanti FX, et al. Limitations of tetrazolium salts in delineating infarcted brain. Acta Neuropathol. 1984; 65 (2): 150–7.