Изучение гепатопротективной активности терпенсодержащего препарата на модели алкогольного повреждения печени | Выштакалюк А.Б., Парфенов А.А., Маганова Ф.И., Лацерус Л.А.

Введение

Проблема поиска новых гепатопротективных средств, повышающих резистентность печени к действию химических и токсических агентов и нормализующих ее детоксицирующую функцию и метаболизм, в настоящее время остается крайне актуальной [1–4]. Особое внимание заслуживают природные соединения класса терпенов, обладающие широким спектром фармацевтической активности и низкой токсичностью.

Биологически активная добавка (БАД) КардиоОрганик^® Омега-3 содержит набор терпеноидов пихты сибирской (Abies sibirica L.), витамин Е и льняное масло, источник омега-3 жирных кислот. Исследования терпенов, входящих в состав данной БАД, показали, что они обладают антимикробным, противовоспалительным, ранозаживляющим, гиполипидемическим, антиатеросклеротическим и корригирующим действием при метаболическом синдроме [5–7]. С целью оценки влияния терпенов на гепатоциты были изучены противоопухолевые свойства терпенов, входящих в состав КардиоОрганика Омега-3, на клеточных линиях мышиной гепатомы Hepa1–6. Терпены вызывали апоптотическую гибель опухолевых клеток, ингибировали пролиферацию, нарушали митоз и обусловливали остановку клеточного цикла путем понижающей регуляции уровней экспрессии Cyclin D1, E1 и A2. Кроме того, была обнаружена антиангиогенная активность, которая может быть основным механизмом действия, направленного против гепатоцеллюлярной карциномы [8].

Цель исследования: оценить перспективы использования терпенов как потенциальных гепатопротекторов.

Материал и методы

Исследование проведено на 48 самцах крыс Wistar средней массой 323,5±6,5 г в возрасте 2,5–3,0 мес. Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с правилами, утвержденными ГОСТ № 33215–2014 по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник [9].

Для исследования гепатопротективных свойств БАД КардиоОрганик^® Омега-3 использовали модель этанол-индуцированной патологии печени при длительном введении 40% этанола в дозах от 5 мл до 10 мл на 1 кг массы тела, описанную в работах [10–12]. Доза алкоголя свыше 5 мл/кг (в пересчете на человеческий организм соответствует 600–750 мл выпитой водки) при введении животным является токсической, приводит к сильному алкогольному опьянению и интоксикации [10]. Алкоголизация животных при моделировании патологии печени происходит в 3 этапа, продолжительность первого этапа составляет 4 нед. [11].

Животные были разделены на 8 групп по 6 особей. Для моделирования этанол-индуцированной патологии печени животным вводили этанол в дозе 7 мл на 1 кг массы тела в течение 4 нед. Начиная с 3-й недели от начала введения этанола животным вводили тестируемые вещества перорально, продолжая вводить этанол. По окончании введения этанола тестируемые вещества вводили еще 3 дня. После этого всех животных подвергали эвтаназии и осуществляли забор печени и крови для исследований.

Схема введения веществ:

1-я группа: этанол + вода (контроль);

2-я группа: этанол + 12,5 мл/кг льняного масла — 1,25% раствор (контроль 1);

3-я группа: этанол + 25 мг/кг льняного масла — 2,5% раствор (контроль 2);

4-я группа: этанол + 50 мг/кг льняного масла — 5% раствор (контроль 3);

5-я группа: этанол + КардиоОрганик^® Омега-3, доза 12,5 мг/кг, — 1,25% раствор;

6-я группа: этанол + КардиоОрганик^® Омега-3, доза 25 мг/кг, — 2,5% раствор;

7-я группа: этанол + КардиоОрганик^® Омега-3, доза 50 мг/кг, — 5% раствор;

8-я группа: этанол + препарат экстракта плодов расторопши (Карсил® ), доза 100 мг/кг.

Для правильного дозирования исследуемый препарат и льняное масло растворяли в дистиллированной воде с добавлением в качестве эмульгатора нейтрального вещества — полисорбата Twin-80, обладающего более высокой липофильностью по сравнению с полисорбатом Twin-20 и применяемого в пищевой промышленности. Препарат экстракта плодов расторопши растворяли в дистиллированной воде.

Осуществляли контроль общего состояния, оценивали динамику массы тела животных, биохимические показатели крови (АлАТ, АсАТ, АсАТ/АлАТ (коэффициент де Ритиса), билирубин общий, билирубин прямой, билирубин непрямой, общий белок, альбумин, глобулины, γ-глутамилтрансфераза (ГГТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), щелочная фосфатаза, холестерин). Исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе АРД-200 с использованием специальных наборов реагентов.

Рассчитывали массовый коэффициент печени как отношение массы органа к массе тела животного.

Патоморфологические изменения печени оценивали на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, и замороженных срезах, окрашенных суданом черным, а также по методу Ван-Гизона. Исследования проводили на прямом световом микроскопе Nikon H550S с цифровой камерой Nikon и программным обеспечением NIS Basic Research.

Статистическую значимость различий показателей определяли по методу Фишера — Стьюдента. Различия между группами считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования представлены в таблицах 1–4.

Установлено, что в группе контроля введение 40% этанола в течение 4 нед. в дозе 7 мл/кг привело к изменению следующих биохимических показателей крови. Среди маркеров цитолиза уровень АлАТ оставался без изменения, уровень АсАТ снизился в 8,9 раза (p<0,05). Коэффициент де Ритиса при этом снизился в 12 раз, уровень ЛДГ повысился в 4,8 раза (см. табл. 1). Снижение активности АсАТ может быть связано с уменьшением количества функционирующих гепатоцитов и нарушением образования этого фермента в печени.

Уровень билирубина в результате 4-недельного введения этанола не изменился, однако соотношение фракций прямого (конъюгированного) и токсичного непрямого (неконъюгированного) билирубина существенно изменилось: после воздействия этанола бóльшая доля стала приходиться на непрямой билирубин (см. табл. 2). Это является показателем нарушения функции гепатоцитов, связанного с инактивацией (конъюгированием) непрямого билирубина. Уровень активности ГГТ в результате воздействия этанола снизился в 4,4 раза. Поскольку фермент ГГТ образуется в клетках печени, снижение его уровня под действием этанола свидетельствует о снижении функциональной активности гепатоцитов или об уменьшении количества функционирующих клеток печени. Повышение активности щелочной фосфатазы в группе контроля является признаком холестаза.

При исследовании параметров белкового обмена было выявлено, что под действием этанола на 26,5% повысился уровень общего белка сыворотки крови (см. табл. 3). При этом на 14,6% снизился уровень альбумина и почти вдвое повысился уровень глобулинов, т. е. содержание белка менялось за счет глобулинов. Поскольку альбумин синтезируется в клетках печени, его снижение свидетельствует о нарушении белок-синтетической функции гепатоцитов. Рост уровня глобулинов может соотноситься с повышенным образованием белков, связанных с развитием патологического процесса (белки острой фазы, TNFα, иммуноглобулины и т. д.). Уровень холестерина сыворотки под действием алкоголя никак не изменился.

Все тестируемые вещества оказали положительное действие на оцениваемые биохимические показатели крови. Под их влиянием наблюдали: нормализацию (повышение) уровня АлАТ и ГГТ, резко сниженных в сравнении с нормой из-за нарушения функциональной активности гепатоцитов в результате воздействия алкоголя; сдвиг в сторону нормы (повышение) коэффициента де Ритиса; снижение уровня ЛДГ и щелочной фосфатазы; нормализацию соотношения прямого и непрямого билирубина (повышение прямого и снижение непрямого), нормализацию (снижение) уровня общего белка и соотношения альбумина и глобулинов (повышение концентрации альбумина и снижение концентрации глобулинов). На уровень холестерина исследованные вещества не повлияли.

Сравнение групп по биохимическим показателям выявило, что КардиоОрганик^® Омега-3 и Карсил^® проявили более выраженный эффект, чем льняное масло. Так, на уровень АсАТ КардиоОрганик^® Омега-3 оказал эффект в дозах 12,5 мг/кг и 25 мг/кг, а льняное масло — лишь в дозе 12,5 мг/кг. В группе Карсила активность АсАТ и АлАТ была выше нормы. На уровень активности ЛДГ как КардиоОрганик^® Омега-3, так и льняное масло оказали эффект при одинаковых дозах — 25 мг/кг. При введении льняного масла в дозе 25 мг/кг и Карсила в дозе 100 мг/кг снижение ЛДГ было более выраженным, чем при введении КардиоОрганика Омега-3 в дозе 25 мг/кг. Уровень билирубина общего и непрямого в группе льняного масла 25 мг/кг превышал норму. В то же время КардиоОрганик^® Омега-3 в дозе 25 мг/кг оказывал наиболее выраженный положительный эффект на билирубиновый обмен, приводя к снижению концентрации непрямого билирубина. Аналогичный эффект наблюдался и при введении Карсила в дозе 100 мг/кг (см. табл. 3). Достоверное снижение уровня щелочной фосфатазы наблюдалось лишь при введении льняного масла в дозе 12,5 мг/кг, в то время как КардиоОрганик^® Омега-3 приводил к достоверному снижению содержания щелочной фосфатазы при применении всех исследованных доз (12,5, 25 и 50 мг/кг). Под действием Карсила снижение уровня щелочной фосфатазы было недостоверным. КардиоОрганик^® Омега-3 и Карсил® оказали более выраженный положительный эффект также на показатели белкового обмена по сравнению с льняным маслом, так как уровни глобулинов и альбумина в первых двух группах наиболее приближены к показателям интактной группы (см. табл. 3).

За время эксперимента наблюдалась положительная динамика массы тела без статистически значимого различия между группами. Лишь в группе Карсила прирост массы тела был достоверно ниже, чем в группе контроля. Массовый коэффициент печени в группе контроля увеличился по сравнению с интактными (нормой) на 26,9%. В группах крыс, которым вводили тестируемые вещества, массовый коэффициент печени был ниже, чем в группе контроля, хотя различия были статистически незначимыми. Наименьшие значения (3,03±0,17%) были в группе, которой вводили КардиоОрганик^® Омега-3 в дозе 25 мг/кг (см. табл. 4).

При патоморфологическом анализе гистологических образцов печени было показано, что в группе контроля, по сравнению с группой интактных животных (рис. 1), в результате воздействия этанола появляются изменения, свидетельствующие о деструктивно-дегенеративных изменениях в печени и холестазе: нарушение структурной организации клеток, значительное сужение межклеточного пространства, повышенное кровенаполнение; разреженность цитоплазмы гепатоцитов (гидропическая дистрофия) (рис. 2, А). При большом увеличении (рис. 2, B, С) видны клетки без ядер, что является признаком фокального некроза гепатоцитов. В клетках выявляется сильно выраженная базофильная зернистость цитоплазмы — зернистая дистрофия. Наблюдается умеренная инфильтрация ткани печени лимфоидными клетками (рис. 2, С). Повышенного образования липидов под действием этанола не выявлено (рис. 2, D), т. е. выявляемая оптически разреженная цитоплазма в гепатоцитах при окрашивании гематоксилином и эозином связана с некротическими деструктивно-дегенеративными процессами, а не с накоплением в клетках жира. При окрашивании по Ван-Гизону выявляется повышенное образование коллагеновых волокон, преимущественно вокруг сосудов. Отдельные волокна также отмечены непосредственно в дольках печени, между гепатоцитами (рис. 2, E, F).

В результате воздействия исследованных веществ (льняное масло, КардиоОрганик^® Омега-3 и Карсил^®) было показано улучшение структурно-морфологической организации печени. Наблюдали уменьшение признаков гидропической и зернистой дистрофии, некроза гепатоцитов, а также фибротических изменений. Повышенного образования липидов в печени не было отмечено ни в одной группе.

Выявлены следующие особенности действия веществ в зависимости от доз. Патоморфологические изменения в печени под действием льняного масла в дозе 50 мг/кг практически не отличались от таковых в группе контроля. Наибольший эффект отмечен под действием льняного масла в дозах 12,5 мг/кг и 25 мг/кг. Для КардиоОрганика Омега-3 наибольший эффект на патоморфологические изменения в печени выявлен при дозе 25 мг/кг (рис. 3). В группах, в которых вводили Кардио­Органик^® Омега-3, признаки гидропической и зернистой дистрофии были менее выражены, чем в соответствующих группах контроля с льняным маслом. В группе Карсила минимальными были признаки зернистой дистрофии и фибротических изменений (выявление коллагеновых волокон по Ван-Гизону), однако имели место признаки гидропической дистрофии (рис. 4).

В целом при сравнении гепатопротективного эффекта терпенсодержащей БАД КардиоОрганик^® Омега-3 и препарата Карсил® можно выделить некоторые особенности. Под действием Карсила наблюдалось более выраженное снижение уровня активности ЛДГ в сравнении с эффектом КардиоОрганика Омега-3. Однако активность специфических маркеров цитолиза печени — ферментов АлАТ и АсАТ в группе Карсила превышала уровень нормы, причем повышение АсАТ было статистически значимое (см. табл. 2), что свидетельствует об активном процессе цитолиза гепатоцитов. Полученные результаты согласовывались с данными патоморфологических исследований печени, согласно которым в группах КардиоОрганика Омега-3 деструктивно-дегенеративные повреждения гепатоцитов (гидропическая дистрофия) были минимально выраженными. В то же время в печени крыс группы Карсила встречались гепатоциты с гидропической дистрофией, являющейся одной из стадий деструкции и некроза клеток. С другой стороны, Карсил^® оказал более выраженный антифибротический эффект в печени. На уровень активности щелочной фосфатазы, ГГТ и билирубинового обмена КардиоОрганик^® Омега-3 в оптимальной дозе 25 мг/кг оказал равноценный эффект в сравнении с Карсилом в дозе 100 мг/кг, нормализовав активность ферментов и соотношение уровней прямого и непрямого билирубина (снижение концентрации токсичного непрямого, или неконъюгированного, билирубина и повышение концентрации прямого, конъюгированного билирубина). На показатели белкового обмена КардиоОрганик^® Омега-3 и Карсил^® оказывали равнонаправленный эффект, вызывая снижение концентрации глобулинов, в состав которых входят белки острой фазы, и повышение концентрации альбуминов, что является показателем улучшения белок-синтетической функции печени. При этом в группе, которой вводили Карсил, различия уровней альбумина и глобулина по сравнению с группой контроля были более выраженными.

Заключение

В ходе исследования установлено, что терпенсодержащая БАД КардиоОрганик^® Омега-3 проявляет гепатопротективные свойства на модели алкогольного повреждения печени у крыс. Под ее действием нормализуются биохимические показатели крови (показатели АсАТ, ГГТ, щелочной фосфатазы, билирубинового и белкового обмена), снижаются выраженность гидропической и зернистой дистрофии гепатоцитов и фибротических изменений в печени и массовый коэффициент печени. Показано, что по гепатопротективному эффекту КардиоОрганик^® Омега-3 в исследованных дозах сопоставим с известным гепатопротектором — препаратом Карсил^® в дозе 100 мг/кг, а по некоторым показателям даже превосходит его. Наиболее выраженный гепатопротективный эффект КардиоОрганика Омега-3 на модели алкогольного повреждения печени выявлен при введении в дозе 25 мг/кг. Все это позволяет рассматривать терпенсодержащие соединения как перспективные гепатопротекторы.

Исследование проведено при поддержке ООО «Инитиум-Фарм».

Конфликт интересов: Маганова Ф.И., Лацерус Л.А. являются представителями компании ООО «Инитиум-Фарм».

Вклад авторов: Маганова Ф.И., Лацерус Л.А. — авторы идеи, научное консультирование, редактирование статьи; Выштакалюк А.Б., Парфенов А.А. — проведение исследования, анализ и статистическая обработка данных, написание статьи.