Бактериальные биопленки в ортопедии: проблема и возможные перспективы профилактики | Гордина Е.М., Божкова С.А.

Введение

В настоящее время потребность в костных и суставных протезах растет из-за старения населения и, вероятно, будет продолжать расти в будущем [1, 2]. Даже с учетом современных широко используемых методов профилактики и асептической хирургической техники частота перипротезной инфекции (ППИ) после вмешательства не снижается ниже 1–2% [3, 4].

Особенностями развития инфекционных осложнений ортопедических вмешательств являются слабовыраженная воспалительная реакция организма пациента, а также способность патогенов к адгезии и биопленкообразованию на поверхности костей и имплантатов, что обусловливает низкую эффективность лечения ввиду устойчивости возбудителей к антибиотикам и факторам иммунной защиты организма [5]. Длительно текущая хроническая инфекция костей может приводить к таким осложнениям, как амилоидоз почек, дистрофические изменения паренхиматозных органов и формирование септикопиемических очагов [6], при этом основной причиной формирования инфекционного очага и развития рецидивов заболевания считают биопленкообразование патогенов [7, 8].

Биопленки: особенности строения и функционирования

Биопленки образованы микробными сообществами, которые встроены в самостоятельно продуцируемую матрицу внеклеточных полимерных веществ (extracellular polymeric substances) [9]. Матрикс, в свою очередь, объединяет бактериальные клетки в единую систему и выполняет структурно-образующую функцию. Например, полимерный матрикс Staphylococcus aureus может быть образован полисахаридами на основе β-1,6-N-ацетилглюкозамина (PNAG), белками (семейства Bap, Rbf), внеклеточной ДНК, а у Pseudomonas aeruginosa — полисахаридами (альгинат, Psl, Pel), протеинами (CdrA) и внеклеточной ДНК [10]. Толщина и структура пленок могут варьировать от монослоя до многослойного плотного сообщества клеток и зависят от таксономической принадлежности микроорганизма, длительности контакта микробов с поверхностью, свойств субстрата, на который происходит адгезия, а также ряда других факторов [11].

Закрепленные в матриксе бактерии претерпевают ряд метаболических изменений, приобретая отличия друг от друга. Даже в моновидовых биопленках сосуществуют бактерии в различных состояниях [12]. В настоящее время выделяют четыре основных метаболических состояния внутри биопленки: аэробное, ферментативное, спящее, мертвое [13].

Различия формируют несколько бактериальных фенотипов: клетки-персистеры, малые колонии (SCV — small colony variants) и жизнеспособные, но некультивируемые (VBNC — viable but non-culturable) бактерии [14, 15].

Клетки-персистеры — это бактерии, которые уже присутствуют в планктонной популяции. Они могут выдерживать высокие концентрации противомикробных препаратов и чаще обнаруживаются в биопленках [16].

Формирование SCV-фенотипа происходит в результате замедления метаболизма, роста и секреции цитотоксического фактора. Такие бактерии характеризуются меньшим размером колоний, формируемых на питательных средах [17, 18]. Перестройка на SCV-фенотип и бактериальная интернализация увеличивают выживаемость и время существования инфекта в организме хозяина [17].

Состояние VBNC соответствует метаболически наименее активным бактериям, не способным расти на питательных средах. Именно это состояние микробов в биопленках может возникать под воздействием антибиотиков [19]. Поскольку значительная часть антибиотиков нацелена на активные бактериальные клетки, эти метаболические адаптации являются ключевым фактором биопленочной устойчивости бактерий [5].

Рассеивание кластеров микроорганизмов позволяет персистировать источнику резистентной бактериальной популяции, а также обеспечивать непрерывную микробную диссеминацию в различные локусы организма, приводя к хронизации инфекционного процесса.

S. aureus, включая метициллинчувствительные (MSSA) и метициллинрезистентные (MRSA) штаммы, является наиболее распространенным видом, вызывающим ортопедическую инфекцию [6]. Streptococcus spp., Enterococcus spp., Cutibacterium acnes — это прочие виды, часто выступающие этиологическими факторами ППИ, но только S. aureus ответственен за около 50% всех ППИ [5]. Причем если ранее рассматривали только S. aureus как наиболее актуальный этиопатоген в случаях инфекционных осложнений эндопротезирования крупных суставов, то в настоящее время повсеместно растет частота ППИ, обусловленных коагулазонегативными представителями рода, преимущественно S. epidermidis [20, 21].

Существование в биопленке обеспечивает долгосрочное выживание патогенов в макроорганизме, а также наносит значительный ущерб окружающей ткани. В инфицированных тканях патоген-ассоциированные молекулярные паттерны взаимодействуют с врожденными Toll-подобными рецепторами, экспрессируемыми на различных типах клеток, а также стимулируют высвобождение воспалительных цитокинов, включая ИЛ-1 и ИЛ-6. Это приводит к активации и дифференцировке остеокластов и повышенной продукции остеобластами рецептора-активатора ядерного транскрипционного фактора каппа-В лиганд (RANKL — Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand). RANKL является ключевым звеном гомеостаза костной ткани, непосредственно регулирующим дифференцировку и активацию остеокластов и остеолиз. Активация Т-лимфоцитов приводит к индукции экспрессии цитокинов, повышению остеокластогенеза, потере костной ткани и, как следствие, к нестабильности компонентов эндопротеза [22].

Подходы к профилактике пленкообразования

Логичным представляется вопрос о возможности модификации поверхности имплантата с целью придания ей антиадгезивных и противомикробных свойств для предотвращения формирования микробных биопленок. В 1987 г. A. Gristina [23] впервые предложил концепцию конкуренции за поверхность, в которой судьба имплантата из биоматериала зависит от баланса между тканевой интеграцией и микробной адгезией с образованием биопленки. В рамках этой концепции была выдвинута гипотеза о том, что модификации материалов, которые усиливают остеоинтеграцию при одновременном подавлении бактериальной адгезии, могут обеспечить теоретическое преимущество и устранить риск образования биопленок и развития инфекции [24], что послужило толчком для дальнейших исследований.

C.L. Romanò et al. [25] классифицировали методики получения антибактериальных покрытий имплантатов на три основные группы:

Пассивная обработка поверхности с антиадгезивными свойствами без высвобождения антибактериальных компонентов. Данная методика не обеспечивает достаточный бактерицидный эффект, необходимый для устранения инфекционного агента, поскольку их действие ограничено периимплантационной областью.

Активная обработка поверхности с последующей элюцией антибактериальных средств.

Периоперационные антибактериальные носители или покрытия, наносимые во время операции (в том числе биоразлагаемые).

Вторая и третья группы обеспечивают только временное решение проблемы, так как их бактерицидный эффект нивелируется со временем.

Существует мнение, что оптимальная поверхность имплантата должна обладать сильным антиинфекционным потенциалом, продолжительным действием, стабильностью, не быть токсичной и вызывать минимальную реакцию со стороны макроорганизма [26].

Для достижения пролонгированного выраженного антимикробного и антибиопленочного действия поверхности могут быть физически и механически обработаны, а также покрыты или химически модифицированы. Ряд антиадгезивных покрытий на титан созданы путем изменения поверхности полимерами, сополимерами или белками. Так, D. Curto et al. [27] показали, что кристаллическая фаза оксида титана на поверхности биоматериалов снижает адгезию бактерий, не влияя на биосовместимость. S. Ferraris et al. [28] продемонстрировали, что механически получаемые нанобороздки (0,1–0,2 мкм) и кератиновые нановолокна могут увеличивать биосовместимость без увеличения степени микробной адгезии. M. Lorenzetti et al. [29] применили гидротермические методы лечения для достижения аналогичного снижения бактериальной адгезии. Полученные результаты указывают на существование возможности модификации поверхности биоматериала с целью предотвращения адгезии патогенов и формирования на его поверхности микробных биопленок.

В профилактике развития любой имплантат-ассоциированной инфекции ключевым моментом является предупреждение формирования зрелой биопленки, иными словами — микробного очага. При первичном эндопротезировании первая линия «обороны» — это антибактериальные препараты в рамках периоперационной антибиотикопрофилактики. Кроме того, некоторые исследователи рекомендуют применение антибиотиков в составе костного цемента, которым фиксируют компоненты эндопротеза, что, по их мнению, обеспечивает первоначальный защитный барьер против инфицирования эндопротезов [30, 31]. Повсеместно импрегнацию костного цемента дополнительным антибиотиком, как правило ванкомицином, используют при лечении ортопедической инфекции [7].

Существуют данные о возможности физической модификации поверхности для адсорбции антибиотиков или просто применения простого погружения имплантата в антибактериальные препараты для создания временного покрытия с антимикробными и противобиопленочными свойствами [32]. Известно, что антибиотики, ковалентно связанные с металлическими поверхностями, ингибируют бактериальную колонизацию как in vitro, так и in vivo [24]. Однако антибактериальные препараты, дополнительно вносимые в костный цемент, должны соответствовать определенным требованиям — отличаться безопасностью, термостабильностью, гипоаллергенностью, водорастворимостью, иметь адекватный спектр бактерицидной активности; должна быть возможность получения препарата в форме стерильного порошка или лиофилизата [33].

По точкам приложения механизма действия Brackman и Coynye [34] разделили противобиопленочные агенты на группы, воздействующие на:

системы межбактериальной коммуникации, в частности на аутоиндуктор AI-2 (грамотрицательных бактерий), диффузный фактор сигнала (diffusible signal factor);

транскрипционную активность грамнегативных бактерий (деценовая кислота и др.);

механизмы обеспечения железом (лактоферрин, препараты галлия, пиовердин и др.);

молекулы стенки бактерии (например, D-аминокислоты препятствуют закреплению белковых амилоидных волокон; сарагозиновая кислота (zaragozic acid) нарушает архитектуру микродоменов в клеточных мембранах);

межбактериальные взаимодействия (антиматриксные молекулы, например норспермидин (norspermidine), AA-861, партенолид (parthenolide), рамнолипид (rhamnolipid) и другие бактериальные поверхностно-активные вещества);

молекулы, способствующие гибели клеток (индукторы синтеза оксида азота, вызывающего гибель бактерий).

Одним из перспективных направлений борьбы с биопленкообразованием на поверхностях ортопедических имплантатов является применение химических агентов, в том числе металлов (серебро, золото, медь, кобальт) и галогенов [35].

Антимикробное действие серебра связано с взаимодействием его ионов с тиольными группами ферментов и белков, а также с влиянием на высвобождение ионов К⁺ из бактериальной клетки [36]. Кроме того, предполагается, что механизм действия серебра заключается в образовании активных форм кислорода и биологически активных ионов, которые повреждают клеточные стенки бактерий, связываются с нуклеиновыми кислотами, препятствуя размножению бактерий [37]. N. Harrasser et al. [38] изучали антимикробные эффекты серебра и наблюдали значительную антимикробную активность, которая положительно коррелировала с концентрациями серебра. Кроме того, V. Aurore et al. [39] определили, что наночастицы серебра усиливают бактерицидную активность в остеокластах. К числу преимуществ ионов серебра относятся антиадгезивное действие и предупреждение образования биопленок на поверхности спейсера из ПММА [40, 41].

K. Kalishwaralal et al. [42] продемонстрировали, что наночастицы серебра в концентрации 100 нМ почти полностью предотвращали биопленкообразование штаммов S. epidermidis и P. aeruginosa. В другом исследовании [43] костный цемент, импрегнированный серебром, значительно снижал биопленкообразование патогенов в сравнении со стандартным цементом. В ряде экспериментов отмечен синергичный эффект серебра в комбинации с антибиотиками [44–46]. Значимым преимуществом поверхностей, покрытых наночастицами серебра, является их способность непрерывно высвобождать действующее вещество в перипротезную область в течение значительного периода времени, таким образом, действуя как на поверхностном слое, так и непосредственно в окружающей среде [45].

Сравнительно недавно было установлено, что йод является успешным адъювантом для ирригации и санации в случаях ППИ [47]. На сегодняшний день описаны различные методики обработки поверхности имплантата растворами йода. N.M. Brown et al. [49] показали эффективность 10% повидон-йода при обработке им хирургической раны и поверхности имплантата. После имплантации протезных компонентов рану пропитывали раствором повидон-йода, а перед окончательным ее закрытием препаратом обрабатывали кожу вокруг разреза [47]. Адаптировав эту идею к поверхностям имплантатов, H. Tsuchiya et al. [48] провели клиническое исследование, в которое включили 222 пациента с послеоперационной инфекцией, в комплексном лечении которых использовали титановые имплантаты с йодной подложкой. Такие имплантаты показали свою эффективность в профилактике и лечении инфекции, связанной с ортопедическими вмешательствами. T. Shirai et al. [49] показали значимое снижение частоты инфекции, связанной с остеосинтезом, при использовании обработанных йодом внутренних и внешних фиксаторов. Толщина пленки анодного оксида составляла от 10 мкм, с более чем 50 000 пор/мм²
и способностью удерживать 10–12 мкг/см² йода. T. Kabata et al. [50] также оценили клиническую эффективность и безопасность титановых имплантатов, покрытых йодом.
Из 14 случаев лечения ППИ и 13 случаев первичного тотального эндопротезирования у иммуносупрессивных пациентов ни в одном случае не было диагностировано инфекционных осложнений и не получено данных о проблемах, связанных с локальной токсичностью применения препаратов йода или с нарушением остеоинтеграции покрытых йодом имплантатов. Таким образом, можно отметить, что йод, как и наночастицы серебра, обладает определенным антибиопленочным потенциалом.

Заключение

Подводя итог, можно сказать, что биопленкообразование — это естественный процесс существования микроорганизмов в окружающей среде и в организме хозяина, обеспечивающий их выживание. Состояние биопленки позволяет бактериям быть толерантными к лечению антибиотиками и к воздействию факторов иммунной системы из-за структурной и метаболической гетерогенности, которая обусловлена одновременным сосуществованием микробных клеток в различных состояниях, сочетающимся с активным синтезом межклеточного матрикса. Кроме того, близость бактерий в состоянии биопленки индуцирует возможность обмена генами устойчивости к антибактериальным препаратам.

Одним из неблагоприятных последствий биопленочных инфекций является чрезмерное потребление антибактериальных препаратов (в основном без какого-либо терапевтического эффекта) в случае сохранения инфицированного имплантата, что также способствует прогрессированию устойчивости возбудителей к антибиотикам.

Профилактика образования пленок на поверхностях имплантатов представляется одним из перспективных методов борьбы с хроническими рецидивирующими имплантат-ассоциированными инфекциями. В травматологии и ортопедии в профилактических и терапевтических целях помимо системного и локального (в составе костного цемента) применения антибиотиков возможно использование различных материалов для создания имплантатов с определенными физическими и химическими свойствами поверхностей. Однако, несмотря на все оптимистичные результаты, большинство систем находятся на этапе изучения и их трудно масштабировать до отраслевых стандартов, что требует дальнейших исследований.

По-видимому, в идеале необходима технология, которая позволяет интегрировать биологическую защиту в конструкцию имплантата, обеспечивая пролонгированную антимикробную и антибиопленочную защиту в течение срока службы заменяющего протеза и не вызывая селекцию антибиотикоустойчивых штаммов бактерий.