Ассоциация относительной длины теломер и генетического варианта генa SIRT1 с возрастной макулярной дегенерацией | Мошетова Л.К., Дмитренко О.П., Абрамова О.И., Карпова Н.С., Туркина К.И., Сабурина И.Н.

Введение

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) — сложное многофакторное состояние, включающее в себя множество генетических, экологических и конституциональных факторов и характеризующееся поражением макулярной зоны сетчатки [1]. Согласно прогнозу W.L. Wong et al., опубликованному в 2014 г., это число будет расти по мере старения населения мира и к 2040 г. достигнет 288 млн человек [2].

Одним из наиболее значимых факторов, предрасполагающих к развитию ВМД, считается старение, в процессе которого на клеточном уровне ключевую роль играют теломеры. Их укорочение с возрастом рассматривается как существенный вклад в старение организма [3, 4]. Теломеры — это нуклеопротеиновые структуры, локализующиеся на концах эукариотических хромосом [5]. Хорошо известно, что теломеры постепенно укорачиваются при каждом делении клетки. Кроме того, причиной укорочения теломер может быть их повреждение в результате воздействия нуклеаз и других деструктивных факторов (активные формы кислорода, свободные радикалы) [6].

За последнее десятилетие ряд исследований продемонстрировали связь между геномной стабильностью, заболеваниями, ассоциированными с возрастом, и старением, которые опосредуются уровнем активности НАД⁺-зависимых ферментов, в том числе и SIRT1 [7, 8]. SIRT1 относится к семейству гистоновых деацетилаз III класса и обеспечивает гомеостаз теломер, индуцируя экспрессию белков теломеразы и шелтерина и регулируя образование гетерохроматина теломер [9]. Снижение НАД⁺ в процессе старения способствует инактивации SIRT1, что приводит к укорочению теломер и генетической нестабильности клеток [10]. В свою очередь, дисфункция теломер приводит к подавлению экспрессии SIRT1 [11]. На функцию фермента SIRT1 влияет экспрессия гена SIRT1, расположенного в 10-й хромосоме в области q21.3 [12]. Длина теломер, признанная многими исследователями биомаркером старения и ассоциированных с возрастом заболеваний, имеет значительные различия у разных людей и варьирует в разных популяциях [13, 14]. На сегодняшний день выявлено лишь несколько однонуклеотидных полиморфизмов, которые могут быть вовлечены в регуляцию длины теломер [15].

ВМД является распространенным полигенным заболеванием, при котором влияние генетических факторов объясняет до 71% вариабельности заболевания [16]. По данным международного консорциума генома ВМД (The International AMD Genomics Consortium), на сегодняшний день идентифицировано 52 генетических варианта, локализованных в 34 локусах, ассоциированных с риском развития ВМД [17].

Мы предположили, что полиморфизм rs12778366 гена SIRT1 может быть важной детерминантой развития ВМД и может участвовать в регуляции длины теломер.

Цель исследования: выявить ассоциацию относительной длины теломер клеток буккального эпителия и генетического варианта rs12778366 генa SIRT1 с поздней стадией ВМД.

Материал и методы

В исследовании принимали участие 100 пациентов (200 глаз), прошедших диагностическое обследование в офтальмологическом отделении ГБУЗ ГКБ им С.П. Боткина ДЗМ на клинической базе кафедры офтальмологии РМАНПО. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» и соответствовало рекомендациям STREGA (Strengthening the reporting of genetic association studies) [16].

Критерии включения в основную группу: наличие диагноза «ВМД поздней стадии («сухой» или «влажной»  формы)» и возраст старше 45 лет. Критерии включения в контрольную группу: отсутствие диагноза в аналогичном возрасте. Критерием исключения для обеих групп было наличие острых и хронических заболеваний в стадии обострения органов зрения, глаукомы, увеита различной этиологии, полной осложненной катаракты, отслойки сетчатки, рубеоза радужки. Также в исследование не включались пациенты с аутоиммунными и онкологическими процессами любой локализации.

В исследовании использовалась геномная ДНК, выделенная из образцов буккального эпителия методом фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфного локуса rs12778366 гeнa SIRT1 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием технологии конкурирующих TaqMan-зондов в лаборатории регенерации репаративных процессов ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии». Анализ длины теломер проводился методом ПЦР в реальном времени по оригинальному протоколу (Cawthon, 2002), с использованием специфических праймеров. Относительную длину теломер (ОДТ) оценивали по показателю T/S, который рассчитывали как отношение числа копий теломерных повторов к числу копий референсного гена.

Статистический анализ проводили с использованием программного пакета GNU PSPP version 1.2.0 (Free Software Foundation, USA) и Microsoft Office Excel 2016. Проверка нормальности распределения признаков проводилась с использованием теста Колмогорова — Смирнова. Количественные данные представлены в виде средних значений и стандартных отклонений (М±SD). При нормальном распределении параметров использовался однофакторный дисперсионный анализ (One Way ANOVA). Значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для непрерывных переменных и критерия χ² для категориальных переменных. Для сравнения непараметрических данных между двумя группами использовался критерий Манна — Уитни. Уровень значимости считался достоверным при р<0,05. Частотные характеристики генотипов и аллелей представлены в абсолютных числах и процентах. Для определения достоверности между сравниваемыми группами по частотным характеристикам генотипов и аллелей исследуемого полиморфизма применяли тесты на соблюдение равновесия Харди — Вайнберга и выявление ассоциаций в программе DeFinetti. Сила ассоциации анализируемых признаков определялась с помощью величины отношения шансов (ОШ) с доверительным интервалом (ДИ) при 95% уровне значимости. Предполагаемый фактор риска считался значимым при значении показателя ОШ больше единицы с поправкой на ДИ.

Результаты

В основную группу вошли 50 пациентов с диагнозом «ВМД, поздняя стадия (категория 4 AREDS) », из них 37 женщин (74,0%) и 13 мужчин (26,0%) в возрасте от 47 до 82 лет (средний возраст 70,32±9,2 года). Контрольную группу составили 50 пациентов без ВМД — 38 женщин (76,0%) и 13 мужчин (24,0%) в возрасте от 46 до 85 лет (средний возраст 65,86±10,22 года).

Пациенты контрольной группы были моложе пациентов с ВМД (р<0,012). По полу группы были сопоставимы (р=0,05).

Проведенный анализ полиморфизма rs12778366 в гене SIRT1 позволил оценить частоту встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса исследуемого гена у пациентов с ВМД. Выявлено, что частота встречаемости аллеля С в основной группе составила 25,0%, тогда как в группе контроля — 14,0% (р=0,049). Частота встречаемости гетерозиготного генотипа ТС в 2 раза выше в основной группе по сравнению с группой контроля (р=0,045). При анализе ассоциаций установлена взаимосвязь полиморфизма rs12778366 гена SIRT1 с ВМД. Так, гетерозиготный генотип ТС является генетическим фактором предрасположенности к данному заболеванию, увеличивая риск его развития в 2,048 в общей модели наследования и в 2,425 раза — в доминантной. Результаты представлены в таблице 1.

ОДТ клеток буккального эпителия у пациентов основной группы составила 0,75±0,06, в группе контроля — 0,84±0,14 (р=0,274). Медиана относительной длины теломер в контрольной группе составила 0,814. Исходя из этого, пациенты с длиной теломер ниже этого показателя были отнесены к группе коротких теломер, в группу длинных теломер были включены те, у кого этот показатель превышал медианное значение.

Анализ распределения теломер по длине между основной и контрольной группами показал статистически значимые различия: пациентов с короткими теломерами было больше в основной группе (64,0%), чем в группе контроля (48,0%), р=0,0002 (рис. 1).

Пациенты основной группы в зависимости от ОДТ были разделены на 2 подгруппы. В подгруппу I вошли пациенты с длинными теломерами, подгруппу II составили пациенты с короткими теломерами. Анализ частотного распределения генотипов и аллелей полиморфизма rs12778366 гена SIRT1 в подгруппах показал, что частота встречаемости аллеля С выше в подгруппе II по сравнению с подгруппой I (26,8% и 1,7% соответственно, p=0,013) (табл. 2).

Заключение

В нашем исследовании проводился анализ ОДТ, изучались частотные характеристики генотипов и аллелей однонуклеотидного пoлимoрфизмa rs12778366 гeна SIRT1 у пациентов с поздней стадией ВМД в сравнении со здоровыми пациентами. Выбранный нами полиморфизм впервые изучался в ассоциации с длиной теломер в российской популяции. Проведенное исследование показало наличие ассоциации полиморфного локуса rs12778366 гeнa SIRT1 с риском развития ВМД у гетерозиготных носителей аллеля С. Выявлено, что у пациентов с поздней стадией ВМД более короткие теломеры. Также установлено, что у носителей аллеля С теломеры короче, что может свидетельствовать о более раннем репликативном старении лиц, страдающих данной патологией.

Основным ограничением этого исследования является небольшой размер выборки. Тем не менее полученные нами данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения выбранного нами полиморфного локуса гена SIRT1 в ассоциации с длиной теломер на большей выборке пациентов, что в дальнейшем может позволить использовать эти молекулярные маркеры в качестве критерия оценки индивидуального прогноза развития ВМД и для проведения эффективных профилактических мероприятий.

Сведения об авторах:

¹Мошетова Лариса Константиновна — д.м.н., профессор, академик РАН, заведующая кафедрой офтальмологии; ORCID iD 0000-0002-5899-2714.

²Дмитренко Ольга Павловна — мл. научный сотрудник; ORCID iD 0000-0002-2067-0971.

¹Абрамова Ольга Игоревна — аспирант кафедры офтальмологии; ORCID iD 0000-0002-6156-6126.

²Карпова Наталия Сергеевна — мл. научный сотрудник; ORCID iD 0000-0001-6391-4908.

¹Туркина Ксения Ивановна — к.м.н., доцент кафедры офтальмологии; ORCID iD 0000-0002-4989-7467.

^2,3Сабурина Ирина Николаевна — д.б.н., профессор; ORCID iD 0000-0003-2014-2535.

¹ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России. 123995, Россия, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.

²ФГБНУ «НИИОПП». 125315, Россия, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

³НИИ молекулярной и персонализированной медицины, ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России. 125284, Россия, г. Москва, 2-й Боткинский пр-д, д. 7, корп. 2.

Контактная информация: Абрамова Ольга Игоревна, e-mail: abramovao2019@mail.ru. 

Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. 

Конфликт интересов отсутствует. 

Статья поступила 11.05.2021.

About the authors:

¹Larisa K. Moshetova — D. Sc. (Med.), Professor, Full-Member of the Russian Academy of Sciences, Honored Doctor of Russian Federation, President of the Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Head of the Department of Ophthalmology; ORCID iD 0000-0001-5081-414X.

²Olga P. Dmitrenko — junior researcher; ORCID iD 0000-0002-2067-0971.

¹Olga I. Abramova — postgraduate student of the Department of Ophthalmology; ORCID iD 0000-0002-6156-6126.

²Natalya S. Karpova — junior researcher; ORCID iD 0000-0001-6391-4908.

¹Ksenia I. Turkina — C. Sc. (Med.), associate professor of the Department of Ophthalmology; ORCID iD 0000-0002-4989-7467.

^2,3Irina N. Saburina — D. Sc. (Biolog.), Professor; ORCID iD 0000-0003-2014-2535.

¹Russian Medical Academy of Continuous Professional Education. 2/1, Barrikadnaya str., Moscow, 125993, Russian Federation.

²Research Institute of General Pathology and Pathophysiology. 8, Baltiyskaya str., Moscow, 125315, Russian Federation.

³Research Institute of Molecular and Personalized Medicine. 7 Build, 2, 2^nd Botkinskiy pass., Moscow, 125284, Russian Federation.

Contact information: Olga I. Abramova, e-mail: abramovao2019@mail.ru. 

Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned. 

There is no conflict of interests. 

Received 11.05.2021.