Связь морфологических изменений эритроцитов с тяжестью доброкачественной механической желтухи: результаты атомно-силовой микроскопии | Пахомова Р.А., Кочетова Л.В., Петрушко С.И., Теплякова О.В., Назарьянц Ю.А., Микитин И.Л., Гуликян Г.Н., Колесник В.Я., Борисова Е.Р.

Введение

Механическая желтуха (МЖ) по-прежнему представляет серьезную проблему для клинической практики, поскольку число пациентов с нарушениями в области гепатопанкреатодуоденального комплекса неуклонно растет. Особенно часто трудности в лечении возникают у людей старших возрастных групп, у которых заболевание нередко сопровождается тяжелыми осложнениями [1, 2]. При этом состояние больного ухудшается, главным образом, из-за снижения функциональной активности печени и формирования печеночной недостаточности. На фоне этих процессов усиливается токсическое воздействие эндогенных метаболитов, активируется перекисное окисление липидов и ослабевают защитные антиоксидантные механизмы [3, 4]. Подобные нарушения постепенно вовлекают в патологический процесс различные органы и системы, что способствует развитию мультиорганной дисфункции и значительно утяжеляет течение заболевания.

В последние годы большое внимание уделяется изучению роли эритроцитов в патогенезе МЖ. Исследования показали, что при обтурационной желтухе изменяются морфология, деформируемость и проницаемость мембран эритроцитов, что нарушает микроциркуляцию и усиливает тканевую гипоксию [5, 6]. Также при билиарной обструкции выявлены изменения липидного состава мембран, повышение их хрупкости и склонность эритроцитов к гемолизу [7, 8].

Современные методы исследования, такие как атомно-силовая микроскопия (АСМ), лазерная дифракция и микро-Раман-спектроскопия, позволяют объективно оценивать механические и структурные свойства клеточных мембран, в том числе эритроцитов, при различных патологических состояниях [9, 10]. Эти подходы открывают новые возможности для оценки влияния МЖ на клеточные мембраны и определения степени тяжести заболевания.

Цель исследования: оценить структурные и функциональные особенности эритроцитов у пациентов с доброкачественной МЖ различной степени тяжести и разработать морфологический индекс билирубин-индуцированных изменений (МИБ) как дополнительный критерий стратификации больных.

Материал и методы

В исследование были включены 84 пациента с доброкачественной МЖ (основная группа). В соответствии с тяжестью состояния, определенной по модифицированной классификации Э.И. Гальперина, пациенты основной группы были разделены на три подгруппы:

группа А — 29 пациентов, средний возраст 62,8±3,1 года;

группа B — 28 пациентов, средний возраст 63,5±2,7 года;

группа C — 27 пациентов, средний возраст 65,0±2,4 года.

Контрольная выборка состояла из 30 здоровых добровольцев, сопоставимых с основной группой по полу и возрасту.

Диагностическая программа включала анализ клинических проявлений, лабораторных показателей и данные инструментальных исследований. Дополнительно у всех пациентов проводилось исследование эритроцитов методами сканирующей зондовой микроскопии.

Для визуализации клеточных структур применяли атомно-силовой микроскоп AFM Solver PRO (NT-MDT Spectrum Instruments, Россия). Полученные изображения анализировались с помощью программного обеспечения SolverViewer и Gwyddion. Для каждого образца исследовали не менее 10 эритроцитов, оценивая их размеры, профиль поверхности, глубину центрального углубления и наличие микродефектов. Для оценки морфологии анализировали мазки с изолированными эритроцитами, исключая влияние соседних клеток, выполняя двойное сканирование: сначала всей клетки, затем — ее мембраны.

Статистическая обработка данных выполнялась с использованием пакета IBM SPSS Statistics 23.0. Качественные показатели представлены в виде абсолютных и относительных величин (%), количественные — как среднее значение и стандартная ошибка (M±m). Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Шапиро — Уилка. При нормальном распределении выборок сравнение проводили с использованием t-критерия Стьюдента; при ненормальном — применяли критерий Манна — Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне p<0,05.

Результаты исследования

При анализе морфометрических параметров эритроцитов, исследованных методом АСМ, выявлены выраженные изменения их геометрии и рельефа поверхности в зависимости от степени тяжести МЖ (табл. 1).

У пациентов группы A отмечалось незначительное увеличение длины эритроцитов при умеренном снижении ширины, что указывает на начальные признаки деформации и уменьшение двояковогнутости дискоцитов. При этом высота клеток возрастала, а площадь поверхности увеличивалась примерно на 10% по сравнению с контрольной группой. Эти изменения, вероятно, связаны с нарушением осмотического баланса и изменением липидного состава мембраны под влиянием билирубина. У пациентов группы B (средняя тяжесть МЖ) наблюдалось дальнейшее увеличение длины и площади эритроцитов, рост максимальной и минимальной высоты клеток, что свидетельствует о потере нормальной формы и переходе к куполообразной конфигурации — стоматоцитам. У таких клеток уменьшается эластичность и способность к деформации, что может приводить к ухудшению микроциркуляции. При тяжелой степени МЖ (группа C) отмечено максимальное увеличение длины, площади и объема эритроцитов — почти в 2 раза по сравнению с контрольной группой. Высота клеток также увеличивалась, что указывает на набухание и утрату центрального просветления. Деформация сопровождается ростом числа микродефектов и нарушением целостности билипидного слоя, что согласуется с данными АСМ.

Таким образом, с прогрессированием МЖ происходит закономерная трансформация эритроцита из двояковогнутого дискоцита в куполообразный стоматоцит, сопровождающаяся увеличением объема, изменением поверхности и ростом повреждения мембраны. Эти изменения можно рассматривать как морфологические маркеры тяжести эндогенной интоксикации и степени билирубинемии.

С учетом продемонстрированных результатов закономерно предложен интегральный показатель — МИБ. Он предназначен для совокупной оценки степени структурной деформации эритроцитов при МЖ и отражает суммарный эффект осмотического дисбаланса, изменений мембранного цитоскелета и токсического воздействия желчных кислот. МИБ включает три морфометрических параметра, которые демонстрируют наиболее устойчивую корреляцию с уровнем билирубина и клинической тяжестью состояния.

Интегральная формула представлена следующим образом:

МИБ = (IF × MD) / CD, 

где: IF — индекс формы эритроцита (IF = длина/ширина); MD — плотность микродефектов билипидной мембраны, отражает токсическое и оксидативное повреждение; CD — глубина центральной впадины, определяет сохранность дискоцитарной конфигурации.

Принцип построения индекса заключается в том, что рост IF и MD указывает на степень токсического воздействия, а уменьшение CD отражает утрату нормальной формы, что в сумме дает объективную характеристику повреждения клетки.

Подсчет MD основан на визуальной оценке АСМ-сканов: учитываются количество, размер и распределение дефектов мембраны эритроцитов. Увеличение выраженности и агрегации дефектов соответствует росту балльной оценки и степени МЖ. По мере прогрессирования МЖ наблюдается переход от практически гладкой поверхности с единичными дефектами (норма) к множественным крупным повреждениям с признаками их агрегации, что и отражается в балльной оценке MD (см. рисунок). Можно выделить следующий подход к подсчету MD:

0,1 балла — дефекты отсутствуют или встречаются единичные;

0,5 балла — множественные мелкие дефекты;

1,5 балла — множественные дефекты в сочетании с единичными крупными;

3 балла — множественные крупные дефекты с признаками агрегации повреждений мембраны.

На основании полученных данных сформирована новая трехуровневая классификация, позволяющая стратифицировать пациентов с МЖ не только по биохимическим, но и по морфологическим критериям (табл. 2).

Данная классификация отражает переход структурного повреждения от функционально обратимых изменений к глубоким деструктивным процессам, сопровождающимся потерей способности эритроцита к деформации и участию в микроциркуляции.

Обсуждение

Смена формы эритроцитов — от двояковогнутой к куполообразной или стоматоцитарной — традиционно связывается с нарушением соотношения мембранных липидов и изменением цитоскелетных взаимодействий. В ряде исследований показано, что при повреждениях мембраны (либо липидной, либо белковой природы) эритроциты теряют способность удерживать форму, становятся более хрупкими и склонными к гемолизу [12]. Учитывая, что при МЖ концентрация билирубина и токсических желчных компонентов значительно возрастает, логично предположить, что именно они — причина мембранных нарушений. Данные исследований подтверждают, что билирубин способен вызывать изменения формы эритроцитов и повышать их склонность к гемолизу [13].

При изменении формы и структуры мембраны деформируемость теряется. Это снижает способность эритроцитов к нормальной микроциркуляции, ухудшает доставку кислорода, способствует тканевой гипоксии, особенно в условиях уже нарушенной функции печени и других органов при МЖ [14]. Поврежденные мембраны легче разрушаются, когда клетка сталкивается со стрессом, слишком сильным для регулировки и поддержания гомеостаза, она часто активирует спе­ци­фические сигнальные каскады, приводящие к определенному типу клеточной гибели [15]. Возрастает риск внутрисосудистого гемолиза, что еще больше усиливает билирубинемию и токсическое воздействие, создавая порочный круг [16].

Заключение

Полученные данные показали, что прогрессирование МЖ сопровождается закономерным усилением морфологических нарушений эритроцитов. По мере нарастания билирубинемии и тяжести заболевания выявлено увеличение площади и объема клеток, утрата двояковогнутой формы с переходом к стоматоцитарной конфигурации, уменьшение глубины центральной впадины и рост числа микродефектов мембраны. Эти изменения отражают нарушения структурной целостности билипидного слоя и снижение деформируемости эритроцитов, что способствует ухудшению микроциркуляции, усилению тканевой гипоксии и усугублению эндогенной интоксикации.

Предложенный МИБ является информативным интегральным показателем степени повреждения эритроцитов, демонстрирующим устойчивую связь с клинической классификацией тяжести МЖ. Включение морфометрических характеристик в диа­гностический алгоритм позволяет повысить точность стратификации пациентов и оценивать эффективность проводимого лечения. Но необходимы дальнейшие исследования для сбора большего количества данных с целью подтверждения корреляции изменения мембраны эритроцита с изменениями в функции красных клеток крови и клинической выраженности МЖ.