Перспективы применения протеомного анализа в офтальмологии | Крылова А.А., Захарчук А.В., Кривошеина О.И., Пеков С.И., Попов И.А.

Введение

Протеомика (от английских слов PROTEins — белки и genOMe — геном) — молодая перспективная наука, позволяющая оценить совокупность белков исследуемого биологического объекта, а также структурно-функциональные свойства белковых молекул и их модификации [1]. В настоящее время особый интерес для практической медицины представляет так называемая клиническая протеомика, которая анализирует белковый состав исследуемой жидкости конкретного пациента и сравнивает его с международными базами данных, в частности Gene Ontology [2], выявляя «биологические маркеры» — молекулы белков, играющие значимую роль в ранней и дифференциальной диагностике различных заболеваний и патологических состояний [3–5]. Кроме того, качественное и количественное изучение белкового состава (протеомное картирование) исследуемого биологического объекта или группы объектов позволяет углубить знания о патогенезе заболевания на молекулярном уровне, а также предположить, какие гены ответственны за экспрессию или подавление выработки того или иного белка, позволяя связать фенотип с генотипом [4]. При этом клиническая протеомика позволяет оценить изменения, происходящие в больном организме на фоне лекарственной терапии, способствуя формированию персонализированного подхода к лечению [4]. Все вышеперечисленное обусловливает повышенный интерес ученых и клиницистов к новой науке и объясняет большое количество научных исследований, посвященных изучению протеома человека.

Протеомика в офтальмологии

На сегодняшний день офтальмология — одна из клинических наук, активно использующая метод протеомного анализа [6]. Наиболее часто объектом исследования становится материал, получаемый в ходе «жидкой биопсии» [4] — слезная жидкость, влага передней камеры или аспират стекловидного тела.

Слеза является одной из самых доступных для исследования биологических жидкостей [4, 7], исследование которой сочетается с неинвазивностью при заборе проб, достаточной изученностью (в настоящее время идентифицировано 1620 белков слезы) [8], а также, в отличие от плазмы крови, в слезе отмечается низкое содержание протеинов «биохимического фона», затрудняющих поиск белков-маркеров [4]. Тем не менее использование слезы в качестве объекта исследования имеет определенные «слабые стороны»: малые объемы забранных проб, возможное ее загрязнение микробиомом конъюнктивальной полости и попадание кератоцитов в полученные образцы [4, 9]. Однако указанные недостатки устраняются путем центрифугирования взятого материала [8], что исключает загрязнение образцов. Для повышения эффективности исследования белкового состава слезы возможно проведение жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, что позволяет идентифицировать вещества, содержащиеся в слезной жидкости в малых концентрациях [10].

Способы сбора слезной жидкости

В настоящее время забор слезной жидкости для протеомного картирования чаще всего осуществляется двумя способами: с помощью тест-полосок Ширмера или посредством микрокапиллярных пробирок, причем каждый из указанных способов имеет свои преимущества и недостатки.

Тест-полоска Ширмера — полоска фильтровальной бумаги размером 0,5×4,0 см, один из концов которой закруглен. Перед исследованием закругленный конец тест-полоски загибают на 0,5 см и помещают за нижнее веко в конъюнктивальную полость исследуемого глаза на 5 мин, в течение которых происходит пропитывание полоски слезой. Преимуществом применения тест-полосок Ширмера является простота их использования, не требующая специального обучения лиц, выполняющих забор проб [4]. При этом пациенты, у которых взятие образцов слезы осуществлялось при помощи и тест-полосок Ширмера, и микрокапиллярных пробирок, отмечают, что первый способ вызывает меньше дискомфорта, вероятно, в связи с гибкостью полосок Ширмера, в отличие от жестких микрокапилляров [9]. Кроме того, тест-полоски легче транспортировать и хранить в течение длительного периода времени благодаря специальному методу высушивания [11]. Указанные преимущества существенно повышают доступность протеомного исследования слезной жидкости и создают основу для формирования биобанков слез [11], а тест-полоски Ширмера используются в большинстве крупных исследований белковых соединений слезной жидкости [8, 12, 13].

Однако, говоря о преимуществах забора слезной жидкости с помощью тест-полосок Ширмера, необходимо отметить и ряд недостатков, обусловленных методологией забора слезы. Так, например, непосредственный контакт полоски фильтровальной бумаги с конъюнктивой век и глазного яблока вызывает раздражение оболочки и провоцирует нежелательное слезотечение [4], которое неконтролируемо может изменить концентрацию белка в полученных образцах [4]. Тем не менее при заборе слезы с помощью тест-полосок Ширмера не рекомендуется использовать местную анестезию, так как при этом снижается слезопродукция [4].

Кроме того, при использовании тест-полосок Ширмера возникают нековалентные взаимодействия белковых молекул слезы с собственно полосками фильтровальной бумаги, что также оказывает непосредственное влияние на получаемый результат [14].

Затруднения при использовании тест-полосок Ширмера возникают и на этапе экстракции материала для проведения масс-спектрометрического анализа слезы. Так, манипуляции, проводимые с тест-полоской после сбора биоматериала, в частности, разрезание полоски, могут привести к ее загрязнению с риском потери белковых соединений. Это, в свою очередь, существенно повышает изменчивость получаемых результатов [15].

Возможная потеря протеинов слезной жидкости на этапе экстракции биоматериала способствовала разработке новых методов выделения белков как с использованием различных экстракционных растворителей, так и с варьированием времени и температуры выдержки тест-полосок для минимизации потерь белковых соединений [12, 13]. Кроме того, разработан метод центрифугирования тест-полосок Ширмера [8], при котором центробежная сила вытягивает слезную жидкость из полосок фильтровальной бумаги без использования специальных буферных растворителей [8, 16].

Однако необходимо отметить, что, несмотря на многообразие способов получения образцов слезной жидкости, существующие на сегодняшний день методы экстракции протеинов из слезы могут привести к ошибкам в идентификации и количественном определении ее белкового состава [4].

Отбор образцов слезы для протеомного картирования с помощью микрокапиллярных пробирок в определенной степени позволяет избежать недостатков тест-полосок Ширмера. В частности, данный способ менее инвазивен (во время забора пробы пробирка не должна касаться слезного мясца или конъюнктивы век и глазного яблока), безопасен и не вызывает рефлекторного слезотечения у пациента [4]. В то же время манипуляцию может проводить лишь специально обученный персонал, что существенно ограничивает применение данного способа забора биоматериала в рутинной клинической практике [4].

Микрокапиллярная пробирка представляет собой полый цилиндр из пластика или стекла, который при взятии слезы располагают в конъюнктивальной полости исследуемого глаза горизонтально по ходу глазной щели таким образом, чтобы слезная жидкость смогла течь в пробирку. Как правило, данным способом можно собрать 3–5 мкл слезной жидкости при общем ее объеме в конъюнктивальном мешке 7–10 мкл [9]. Манипуляция занимает несколько минут, которые необходимы для продуцирования слезы добавочными слезными железами при средней скорости ее базальной секреции 0,5–2,2 мкл/мин в нормальных условиях [9]. В связи с этим использование микрокапиллярных пробирок при заборе слезы для протеомного картирования обеспечивает сбор так называемой «нестимулированной» слезной жидкости, максимально приближенной к своему естественному составу [9].

Недостатком микрокапиллярных пробирок, помимо дискомфорта пациентов при заборе биоматериала и необходимости специального обучения персонала, является моргание пациентов во время взятия слезы, что прерывает манипуляцию и увеличивает время ее проведения. Кроме того, согласно данным T. Sitaramamma et al. [17], длительное закрытие глаз меняет состав протеома слезы. Так, например, непосредственно после сна концентрация белков в слезной жидкости выше, чем в условиях бодрствования, и, хотя объем получаемого биоматериала, как правило, меньше [4, 17], при использовании микрокапиллярных пробирок забор слезы рекомендуется проводить в утренние часы.

Необходимо отметить, что применение обоих способов забора слезы для протеомного картирования обеспечивает сходные количественные результаты исследования слезной жидкости. При этом оба способа обладают высокой чувствительностью к определению белковых соединений. Тем не менее в образцах слезы, взятых с помощью микрокапиллярных пробирок, выявляется большее количество внеклеточных белков, характерных для гуморального пути иммунного ответа, в то время как в образцах слезной жидкости, собранных при помощи тест-полосок Ширмера, содержится больше внутриклеточных белков, в частности белков теплового шока, аннексинов и белков S100 [18].

Возможности использования протеомного анализа слезы в дифференциальной диагностике офтальмопатологии

Благодаря углубленному изучению белкового состава слезной жидкости здоровых добровольцев и созданию международных баз данных, систематизирующих имеющуюся информацию, у офтальмологов появилась возможность идентификации белков — «маркеров» различных заболеваний органа зрения в ходе дифференциальной диагностики патологии глаз. На сегодняшний день наиболее изучены изменения протеома слезы при синдроме «сухого глаза» (ССГ), кератоконусе, катаракте и глаукоме, а также при ряде заболеваний заднего отрезка глаза, в частности при возрастной макулодистрофии (ВМД) и диабетической ретинопатии.

Протеомика слезы при ССГ

Протеомное картирование слезы у пациентов с жалобами на сухость, дискомфорт и чувство засоренности в глазах может быть информативно для дифференциальной диагностики патологических состояний глазной поверхности, например, ССГ на фоне дисфункции мейбомиевых желез (ДМЖ) или в сочетании с эндокринной офтальмопатией, а также при синдроме Шегрена.

Сравнительный протеомный анализ слезной жидкости у пациентов с ССГ вследствие уменьшения продукции слезы и на фоне ДМЖ выявил статистически значимое уменьшение экспрессии 26 белков и повышение уровня сывороточного альбумина при снижении секреции слезной жидкости [19]. При этом патологические изменения глазной поверхности вследствие уменьшения продукции слезы коррелируют с потерей защитных белков, обеспечивающих противовоспалительный эффект и реализацию Т-клеточного иммунного ответа: лактоферрин, липокалин 1 (lipocalin-1), пролин с высоким содержанием белка 4 (Lacrimal Proline Rich 4 protein), липофилин А и липофилин С [19–22].

Однако подобные изменения протеома слезной жидкости выявлены при ССГ на фоне ДМЖ и при синдроме Шегрена [4]. Кроме этого, при аутоиммунном системном поражении соединительной ткани выявлено повышение уровня белков воспаления — трансферрина и С-реактивного белка в сочетании со статистически значимым снижением уровня лизоцима, лактоферрина и эпидермального фактора роста [4], что свидетельствует о наличии хронического вялотекущего воспаления при синдроме Шегрена [4, 22].

В ходе комплексных клинических исследований протеома слезы при ССГ и эндокринной офтальмопатии установлено, что развитие и прогрессирование эндокринной офтальмопатии характеризуется активацией воспалительных белков и подавлением синтеза защитных протеинов [23]. При этом выявление определенных сочетаний белковых молекул и их концентраций (белковые панели) в слезной жидкости позволяют дифференцировать болезнь Грейвса и ССГ [23]. Кроме этого, при неактивной форме эндокринной офтальмопатии после декомпрессионной орбитотомии установлено статистически значимое изменение экспрессии 83 белков слезной жидкости [24]. Проведенное научное исследование позволяет более точно идентифицировать отдельные звенья патогенеза эндокринной офтальмопатии, лежащие в основе появления экзофтальма при неактивной форме заболевания [4].

Протеомика слезы при кератоконусе

Одним из тяжелых заболеваний роговицы, приводящим к значительному, а нередко и необратимому снижению зрительных функций, является кератоконус [25]. По данным ряда научных исследований [4], при этом заболевании обнаруживается разная экспрессия цинк-α2-гликопротеина, лактоферрина и κ-цепи иммуноглобулина. Применение электрофореза в сульфатно-полиакриламидном геле в сочетании с масс-спектрометрией в ходе протеомного анализа слезной жидкости при кератоконусе позволило выявить избыточную экспрессию металлопротеиназы 1, иммуноглобулинов α- и κ, предшественников пролактина, лизоцима С и липокалина 1 [4]. Предполагается, что истончение и изменение кривизны роговицы при кератоконусе в определенной степени связаны с повышением уровня протеаз и уменьшением уровня их ингибиторов [26, 27]. Это, в свою очередь, приводит к потере механических свойств коллагеновых волокон роговицы — ключевому звену патогенеза данного заболевания [27].

Протеомика слезы и влаги передней камеры при глаукоме и катаракте

Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) — заболевание, которое приводит к необратимой атрофии ганглиозных клеток зрительного нерва и выраженному снижению зрительных функций на фоне повышения внутриглазного давления [28]. В большинстве случаев заболевание начинается бессимптомно, что обусловливает необходимость поиска белков-маркеров, обнаружение которых в слезе или внутриглазной жидкости способствовало бы ранней диагностике ПОУГ. Согласно имеющимся данным [29] при развитии глаукомного процесса в слезе уже на начальной стадии обнаруживается повышенный уровень белков воспаления, в частности белка S100. Тем не менее до настоящего времени специфического одиночного белка или комбинации белковых молекул в слезной жидкости, являющихся патогномоничными для ПОУГ, не выявлено [3]. Кроме того, по мнению ряда ученых, более перспективным биоматериалом для протеомного анализа при ПОУГ является влага передней камеры за счет ее непосредственного контакта с дренажной системой угла передней камеры [3]. Забор влаги передней камеры осуществляется в ходе хирургической манипуляции после парацентеза роговицы или во время факоэмульсификации [3]. Для качественной и количественной оценки протеома влаги передней камеры при ПОУГ чаще всего проводится жидкостная хроматография в сочетании с высокоточной тандемной масс-спектрометрией [3].

Протеомный анализ образцов водянистой влаги, взятой у пациентов, страдающих ПОУГ в сочетании с псевдоэксфолиативным синдромом и катарактой, позволил идентифицировать 12 уникальных белков, в частности аполипопротеин C-III (apolipoprotein C-III), коллаген α2(I) цепь и α3 (IX) цепь (collagen α-2(I) и α-3(IX) chain), нейроэндокринный регуляторный пептид-1, -2 (neuroendocrine regulatory peptide-1, -2) и т. д. [3]. Большая часть указанных белковых молекул относится к ингибиторам эндопептидаз, регулирующих обмен веществ во внутриглазной жидкости. Как известно, именно нарушение баланса ингибиторов эндопептидаз, предотвращающих активацию патологического протеолиза, является одним из ключевых факторов патогенеза ПОУГ [3].

Помимо этого, во влаге передней камеры у пациентов с ПОУГ выявлены матриксные металлопротеиназы [3], вызывающие разрушение базальных мембран клеток и лизис компонентов межклеточного матрикса с активацией ангиогенных факторов роста [30], в частности эндотелиального фактора роста сосудов А и фибронектина [1]. В ходе протеомного анализа выявлено также повышение уровня CD44 — гликопротеина, регулирующего клеточную адгезию и миграцию и обеспечивающего межклеточные взаимодействия. CD44 является также рецептором для гиалуроновой кислоты, некоторых лигандов и части матриксных металлопротеиназ [3]. Повышение экспрессии данного белка способствует снижению уровня гиалуроновой кислоты, что может оказывать негативное влияние на трабекулярный аппарат и ускорять апоптоз ганглионарных клеток сетчатки [3].

Н.И. Самохиной и соавт. [3] во влаге передней камеры больных ПОУГ обнаружен белок — ингибитор пептидазы (pigment epithelium derived factor — фактор пигментного эпителия, genename SERPIN F1) семейства серпинов — протеинов, ингибирующих пептидазы. Согласно данным литературы выявленный белок синтезируется клетками пигментного эпителия сетчатки и является природным ингибитором ангиогенеза, защищающим ретинальные клетки от апоптоза [3].

Протеомный анализ образцов влаги передней камеры пациентов с ПОУГ позволил также идентифицировать уникальный белок — аполипопротеин D, снижение уровня которого характерно для псевдоэксфолиативного синдрома. Необходимо отметить, что уменьшение средней интенсивности сигнала данного белка менее 4,8×10^-7 мг/кг может прогнозировать развитие указанного синдрома с чувствительностью 72,7% и специфичностью 100% [31]. Уменьшение уровня аполипопротеина D во влаге передней камеры при глаукомном процессе свидетельствует о снижении ее защитных функций, что, в свою очередь, способствует появлению псевдоэксфолиаций на структурах переднего отрезка глазного яблока. При этом указанный белок обнаруживался только в образцах водянистой влаги передней камеры, в то время как в слезной жидкости при ПОУГ и псевдоэксфолиативном синдроме его выявлено не было, что, вероятно, связано со специфичностью выработки антител [3, 31].

Еще одним значимым белковым соединением, обнаруженным при псевдоэксфолиативной глаукоме, был фибронектин, являющийся адгезивной молекулой для соединительной ткани (тканевая форма белка) и биологических жидкостей (плазменная форма). Данный гликопротеин внеклеточного матрикса выполняет регуляторную и стабилизирующую функции при межклеточных взаимодействиях [3]. Согласно данным литературы [31] при различных видах глаукомы фибронектин обнаруживается в дренажной системе угла передней камеры глазного яблока и в составе псевдоэксфолиаций. При этом уровень фибронектина существенно выше при псевдоэксфолиативной глаукоме, нежели при ПОУГ [3, 31].

Развитие и прогрессирование псевдоэксфолиативной глаукомы сопровождаются повышением содержания во влаге передней камеры уровня металлопротеиназ 2, 3 типов и ингибитора металлопротеиназы 2, что свидетельствует о дисбалансе между протеолитическими ферментами и их эндогенными ингибиторами, являющимися одним из звеньев патогенеза данного вида глаукомы [3].

У больных катарактой в образцах влаги передней камеры в ходе протеомного анализа идентифицировано на сегодняшний день 26 белков [3], таких как α-кристаллин (CRYA), корнеодесмосин, α-цепь тубулина, витамин K-зависимый белок. Как известно, данные белковые соединения входят в состав вещества хрусталика, и их появление во влаге передней камеры обусловлено биохимическими реакциями, возникающими при развитии катаракты [3, 32]. Кроме того, гены α-кристаллина A (CRYAA), β-кристаллина A3 (CRYBA3) и β-кристаллина A4 (CRYBA4) отвечают за нормальное состояние хрусталика, и их мутации способствуют выработке ряда белков, снижающих его прозрачность [3]. Повышение же пептидазной активности влаги передней камеры приводит к протеолизу субъединиц коннексинов с появлением щелей между волокнами хрусталика, прогрессирующим разрушением хрусталиковых волокон и развитием катаракты [3].

Протеомика слезы при ВМД и диабетической ретинопатии

Протеомное картирование слезы в настоящее время начинает активно использоваться для определения биомаркеров патологии заднего отрезка глаза, в частности ВМД, диабетической ретинопатии и т. д.

На сегодняшний день в слезной жидкости больных с различными видами макулярной патологии идентифицировано 342 белка, обеспечивающих развитие оксидативного стресса и воспаления, а также неоваскуляризации хориоретинальных структур [33]. При ВМД впервые выявлены такие протеины, как шутин 1 (shootin-1), гистатин 3 (histatin-3), фидгетин-подобный белок 1 (fidgetin-like protein 1), цитоплазматический актин 1, пролактин-индуцируемый белок 1 и белок S100-A7A [33].

Протеомное картирование слезы у больных диабетической ретинопатией с целью выявления биомаркеров заболевания, согласно признанному мнению [34], является более информативным по сравнению с изучением белкового состава плазмы крови, подверженного значительным изменениям вследствие гипергликемии и гликозилирования белков при сахарном диабете. При диабетической ретинопатии в слезной жидкости выявлено существенное изменение экспрессии таких белков, как липокалин 1, лакритин и лактоферрин [34, 35], что в перспективе может использоваться в качестве эффективного скрининга заболевания [36].

Заключение

Таким образом, протеомный анализ — это высокоинформативный и перспективный метод диагностики социально значимых заболеваний органа зрения. Внедрение высокоточной масс-спектрометрии и использование цифровых технологий для обработки информации открывают широкие перспективы для развития протеомики и создания более персонализированной медицины. Получение новых фундаментальных знаний о патогенезе различных заболеваний глаза на молекулярном уровне позволит определять индивидуальное течение патологии путем установления связей между генотипом и фенотипом пациента и выбирать наиболее эффективное в каждом конкретном случае лечение.

Сведения об авторах:

Крылова Анна Андреевна — к.м.н., доцент кафедры офтальмологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России; 634050, Россия, г. Томск, Московский тракт, д. 2; ORCID iD 0000-0001-8009-6302.

Захарчук Анна Викторовна — клинический ординатор кафедры офтальмологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России; 634050, Россия, г. Томск, Московский тракт, д. 2; ORCID iD 0000-0002-9906-8202.

Кривошеина Ольга Ивановна — д.м.н., профессор, заведующая кафедрой офтальмологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России; 634050, Россия, г. Томск, Московский тракт, д. 2; ORCID iD 0000-0001-7509-5858.

Пеков Станислав Игоревич — к.х.н., научный сотрудник лаборатории масс-спектрометрии Сколковского института науки и технологий; 121205, Россия, г. Москва, Большой бульвар д. 30 стр. 1; доцент департамента молекулярной и биологической физики МФТИ; 141701, Россия, г. Долгопрудный, пер. Институтский, д. 9; ORCID iD 0000-0002-9622-3457.

Попов Игорь Алексеевич — к.ф.-м.н., доцент, руководитель лаборатории трансляционной медицины ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России; 634050, Россия, г. Томск, Московскии‌ тракт, д. 2; руководитель лаборатории молекулярной медицинской диагностики МФТИ; 141701, Россия, г. Долгопрудный, пер. Институтский, д. 9; ORCID iD 0000-0002-5904-2470.

Контактная информация: Крылова Анна Андреевна, e-mail: krilovane@yandex.ru.

Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.

Конфликт интересов отсутствует.

Статья поступила 05.09.2022.

Поступила после рецензирования 26.09.2022.

Принята в печать 17.10.2022.

About the authors:

Anna A. Krylova — C. Sc. (Med.), associate professor of the Department of Ophthalmology, Siberian State Medical University; 2, Moskovskiy tract, Tomsk, 634050, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-8009-6302.

Anna V. Zakharchuk — clinical resident of the Department of Ophthalmology, Siberian State Medical University; 2, Moskovskiy tract, Tomsk, 634050, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-9906-8202.

Olga I. Krivosheina — Dr. Sc. (Med.), Professor, Head of the Department of Ophthalmology, Siberian State Medical University; 2, Moskovskiy tract, Tomsk, 634050, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-7509-5858.

Stanislav I. Pekov — C. Sc. (Chem.), researcher of the Laboratory of Mass Spectrometry, Skolkovo Institute of Science and Technologies; 30, bldg. 1, Bolshoy Blv., Moscow 121205, Russian Federation; Associate Professor of the Department of Molecular and Biophysics, Moscow Institute of Physics and Technology; 9, Institutsky Lane, Dolgoprudny, 141701, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-9622-3457.

Igor A. Popov — C. Sc. (Phys.-Math.), Associate Professor, Head of the Laboratory of Translational Medicine; Siberian State Medical University; 2, Moskovsky Highway, Tomsk, 634050, Russian Federation; Head of the Laboratory of Molecular Medical Diagnostics, Moscow Institute of Physics and Technology; 9, Institutsky Lane, Dolgoprudny, 141701, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-5904-2470. Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned.

There is no conflict of interest.

Received 05.09.2022.

Revised 26.09.2022.

Accepted 17.10.2022.