Связь уровней С-реактивного белка сыворотки с клиническими и серологическими фенотипами системной склеродермии и полиморфизмом rs1205 c/t гена С-реактивного белка | Крылов М.Ю., Ананьева Л.П., Гусева И.А., Конева О.А., Старовойтова М.Н., Самаркина Е.Ю., Коновалова Н.В., Варламов Д.А.

В исследование включены 90 пациентов с диагнозом ССД, находившихся на лечении в клинике ФБГУ НИИР им. В.А. Насоновой в период с 2011 по 2014 г. Все пациенты отвечали критериям Американской коллегии ревматологов классификации 1980 г. [17]. На основании медицинской документации (клинический диагноз при выписке) все пациенты c ССД были классифицированы по клиническим и серологическим вариантам. По клиническому варианту различали лимитированную кожную форму (ЛФ) и диффузную кожную форму (ДФ) (длительность заболевания ≤ 3 лет и >3 лет). Кроме того, все пациенты были стратифицированы по наличию или отсутствию ИПЛ (ИПЛ(+) и ИПЛ(-) соответственно). Диагноз ИПЛ был установлен у пациентов на основании характерной картины по данным мультиспиральной компьютерной томографии грудной клетки. Серологические фенотипы включали пациентов, в сыворотке которых были определены повышенные и нормальные показатели: уровни СРБ+ и СРБн, антитела к топоизомеразе 1 — АТА(+) и АТАн и антитела к центромерам АЦА(+) и АЦАн. АЦА были определены методом непрямой иммунофлюоресценции на HEp-2 клетках с помощью набора реагентов IMMCO Diagnostics США. АТА определяли методом иммуноферментного анализа с использованием набора реагентов Orgentec. Позитивными результатами исследования АЦА(+) считали титры ≥1/160 ед/мл, АТА(+) >25,0 ед/мл.
    Уровни СРБ были определены в мг/л высокочувствительным иммунонефелометрическим методом (вчСРБ). Уровень СРБ >5 мг/л считали повышенным СРБ(+), а уровень СРБ до 5 мг/л — нормальным СРБн.

   Генотипирование

    У 90 больных и 104 практически здоровых неродственных субъектов (персонал института), сопоставимых по полу и возрасту, без симптомов или признаков любого аутоиммунного заболевания, были взяты образцы венозной крови. ДНК выделяли из свежих или замороженных образцов крови, используя набор «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» НПО «ДНК-Технология» (Москва).
    Полиморфизм rs1205 гена CRP изучали, используя аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию в реальном времени. Дизайн праймеров и меченых зондов, их синтез и условия амплификации были разработаны в ЗАО «СИНТОЛ» (Москва). Исследование проведено с использованием амплификатора ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Москва).

   Статистический анализ

    Клинические фенотипы представляли как дихотомические вариабельности. Нормальные распределения сравнивали с использованием дисперсионного анализа ANOVA post hoc или теста Стьюдента и представляли как среднее ± стандартное отклонение (М±δ). Уровень значимости р². Анализ был выполнен с использованием пакета программ Statistica 6.0 (Stat Soft Inc, Tulsa, USA).
    Исследование было одобрено этическим комитетом ФБГУ НИИР им. В.А. Насоновой, письменное информированное согласие было получено у всех пациентов.

   Результаты исследования

    Из 90 пациентов 87,0% (78) составляли женщины. Средний возраст пациентов составлял 49,4±12,6 года, средняя длительность заболевания — 11,1±9,0 лет. ДФ имели 51 (57%) больных, из них у 9 (18%) длительность заболевания была менее 3 лет. В группе больных с ЛФ сходная длительность заболевания была выявлена у 3 (8%). Фенотип ИПЛ(+) был диагностирован у 71 (79%) пациента, АТА(+) — у 50 (55%), АЦА(+) — у 13 (14%) пациентов соответственно. Анализ индивидуальных уровней СРБ показал выраженную вариабельность данного признака. Повышенные концентрации СРБ >5 мг/л были обнаружены у 39 (43%) пациентов, из них у 12 (31%) с ЛФ и у 27 (69%) с ДФ ССД.
    В таблице 1 приведены базовые показатели клинических и серологических фенотипов изученной группы пациентов с ССД.

  Обсуждение результатов

   У 43% больных ССД в нашей выборке были выявлены повышенные уровни СРБ, которые чаще встречались у пациентов с ДФ ССД, небольшой продолжительностью заболевания (менее 3 лет) и наличием серопозитивных аутоантител к топоизомеразе I, что согласуется с рядом сходных исследований в Канаде, Америке и Японии. В канадском исследовании [5] у больных с ДФ ССД средний уровень СРБ был выше, чем у больных с ЛФ (р=0,016). Пациенты с ДФ, особенно с небольшой длительностью заболевания, чаще имели повышенные уровни СРБ, чем больные с большой длительностью ССД (р=0,041). Авторы не выявили корреляции уровней СРБ с уровнями специфических аутоантител. Также было установлено, что выживаемость больных с высокими уровнями СРБ была ниже, чем у больных с нормальными уровнями СРБ. В американской когорте GENISOS [18] достоверно повышенные уровни СРБ были обнаружены у 22% пациентов чаще с ДФ ССД (р=0,040) и среди пожилых больных (р=0,026), чем в контрольной группе. Длительность заболевания, наличие аутоантител не коррелировали с уровнями СРБ. Авторы впервые установили, что базовые значения СРБ могут являться предикторами прогрессирования ИПЛ. Одно из объяснений высоких уровней СРБ может быть связано с влиянием цитокинов, вызывающих повышенное воспаление при раннем начале ССД. При заболевании с большей длительностью нормальные уровни СРБ определяются в большей степени процессом фиброза легочной ткани. Известно, что СРБ является общим маркером воспаления и частью естественного иммунного ответа на системное воспаление в ответ на высвобождение цитокинов интерлейкина-6 (IL-6) и интерлейкина-1β (IL-1β) из поврежденной ткани после взаимодействия с рядом ядерных рецепторов. Ранее было показано, что уровни IL-6 коррелировали с уровнями СРБ (r=0,69) и, как полагают, на 48% могут объяснять вариации в уровнях СРБ [8]. Механизмы, лежащие в основе ассоциации между СРБ и ССД, особенно роль генетических факторов, остаются неясными. Ряд ассоциативных генетических исследований, включая полногеномные (GWAS), показали генетическую детерминированность уровней воспалительных маркеров, включая СРБ, при разных заболеваниях [11].
    В настоящем исследовании мы показали участие генетических вариантов одного из частых полиморфизмов rs1205 C/T гена CRP в регуляции уровня СРБ у больных ССД.
    При сравнении частот генотипов rs1205 полиморфизма между группой пациентов с уровнем СРБ >5 мг/л и группой СРБн нами была установлена достоверно повышенная частота генотипа дикого типа СС у пациентов с высоким уровнем СРБ по сравнению с альтернативной группой пациентов (р=0,022).
    Носители минорного генотипа rs1205TT имели почти на 60% ниже уровень СРБ по сравнению с генотипом rs1205СС дикого типа (11,1±5,9 мг/л и 18,9±18,4 мг/л). Эти данные согласуются с результатами исследования Rhodos et al. [19], где снижение составило 40%, и исследования Ammitzboll et al. [20], где оно достигало 50%, однако Plant et al. [21] такой связи не обнаружили. Необходимо отметить, что указанные исследования были проведены на когортах больных с ревматоидным артритом. Сходные данные были получены на других популяциях больных c кардиоваскулярными заболеваниями [15, 22] и системной красной волчанкой [23].

   Заключение

    Таким образом, в нашей выборке были выявлены повышенные уровни СРБ, которые коррелировали с ДФ пациентов с небольшой продолжительностью заболевания и повышенными уровнями аутоантител к топоизомеразе I, которые могут являться маркерами — предикторами плохой выживаемости пациентов. Кроме того, мы подтвердили ассоциацию между минорным аллелем rs1205T гена CRP и сниженным уровнем СРБ в русской когорте больных ССД. Показано, что rs1205 полиморфизм гена CRP не связан с предрасположенностью к ССД в изученной когорте пациентов.
    Наше исследование имеет ряд ограничений ввиду небольшой выборки пациентов с ССД. Для подтверждения полученных нами данных относительно связи уровней СРБ с полиморфизмом rs1205 гена CRP необходимо использовать другие полиморфизмы гена CRP и большие по размеру выборки пациентов из разных этнических популяций.