Нейтрофильные экстраклеточные ловушки — регуляторы формирования врожденного и адаптивного иммунитета | Казимирский А.Н., Салмаси Ж.М., Порядин Г.В.

Введение

Нейтрофилы — наиболее многочисленная группа лейкоцитов крови, участники реакций местного иммунитета и, одновременно, ключевые факторы врожденного иммунитета. Они представляют собой первую линию защиты при воспалении и инфекциях. Рецепторы клеток врожденного иммунитета взаимодействуют с потенциально опасными лигандами экзогенного или эндогенного происхождения. Поступающие в организм патогены вызывают воспалительную реакцию, привлекающую нейтрофилы из периферической крови в ткани. В очаге воспаления нейтрофилы разрушают микроорганизмы с помощью ряда механизмов, главным образом за счет фагоцитоза, высвобождения противомикробных веществ и формирования нейтрофильных экстраклеточных ловушек (НЭЛ). Процесс образования НЭЛ, называемый также нетозом, является механизмом уничтожения микроорганизмов нейтрофилами [1, 2]. Взаимодействие нейтрофилов с микроорганизмами вызывает активацию клеток и ведет к высвобождению волоконистых сетевидных структур (Neutrophil Extracellular Traps, NET), состоящих из деконденсированной ДНК в комплексе с цитозольными белками, ферментами, белками гранул и гистонами. Такой комплекс обеспечивает достаточно высокую локальную концентрацию антимикробных компонентов, чтобы инактивировать и уничтожить патоген независимо от поглощения нейтрофилами. Хотя механизм образования НЭЛ до конца не изучен, известно, что их образование зависит от активности нейтрофильной NADPH-оксидазы. В небольшом количестве исследований найдены НЭЛ, раскрытие которых происходит без предварительной активации NADPH-оксидазы. Однако антибактериальная эффективность таких НЭЛ, как и ожидалось, оказалась низкой. Установлено, что важным фактором, индуцирующим раскрытие НЭЛ, являются контактные взаимодействия активированных нейтрофилов с клетками, находящимися в состоянии апоптоза. Причем нейтрофилы, содержащие остатки апоптотических клеток, не формируют экстраклеточные ловушки и активируют фагоцитоз [3].

В дополнение к антимикробным свойствам НЭЛ создают барьер, предотвращающий распространение патогена. Большое количество исследований посвящено роли НЭЛ в инфекционном воспалении, продемонстрировано, что для развития воспаления неблагоприятны как недостаточность, так и избыточность формирования НЭЛ. Недостаточность нетоза обусловлена врожденными факторами, а также может быть индуцирована патогенами. Избыточность нетоза ведет к тканевому повреждению за счет действия активных форм кислорода и пептидов с порообразующей активностью (таких как LL-37) и вызывает гемокоагуляцию, тромбозы и гемофагию. В последние годы появились работы, показывающие важную защитную роль НЭЛ, которая заключается не только в прямом уничтожении микроорганизмов, но и в регулировании взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета [4].

Роль НЭЛ в антивирусной защите организма

Вирусная инфекция запускает образование агрегатов митохондриального противовирусного сигнального белка (mitochondrial antiviral-signaling protein, MAVS) обладающего прионоподобной активностью [5], который активно стимулирует иммунную сигнализацию. В контроле MAVS-опосредованной противовирусной передачи сигналов аутофагия играет важную роль. Убиквитин-лигаза (RNF34) связывается с MAVS в митохондриальной мембране после вирусной инфекции и способствует аутофагической деградации MAVS, которая необходима для обновления поврежденных митохондрий при вирусной инфекции. RNF34-опосредованная аутофагическая деградация MAVS регулирует врожденный иммунный ответ, митохондриальный гомеостаз и контролирует внутриклеточное инфицирование [6]. Запуск внутриклеточных реакций инициируется после распознавания вирусных продуктов через патоген-ассоциированные молекулярные паттерны. Такое распознавание инициирует сигнальные каскады, которые активируют внутриклеточную врожденную иммунную защиту и воспалительный ответ, который, в свою очередь, облегчает развитие адаптивного иммунного ответа. Активированные сигналы RIG-I взаимодействуют с адаптерным белком MAVS, что приводит к сигнальному каскаду, который активирует факторы транскрипции IRF3 и NF-κB. Эти действия вызывают экспрессию антивирусных генных продуктов и продукцию интерферонов (IFN) I и III типа, которые приводят к снижению содержания вируса в инфицированной клетке и окружающей ткани [7].

Реакция врожденной иммунной системы на патоген развивается в несколько этапов. Первоначально инфицированные макрофаги и дендритные клетки рекрутируют и активируют нейтрофилы, синтезируя и секретируя IFN-I. На этом этапе патоген взаимодействует с рецепторами врожденного иммунитета (TLR) или внутриклеточными рецепторами RLR (RIG-I, MDA5, LGP2). Группа RLR-рецепторов действуют как сенсоры вирусной репликации в клеточной цитоплазме и детектируют репликацию вирусов путем прямого взаимодействия с молекулами двуцепочечной РНК вирусного генома. Нейтрофилы периферической крови поступают в очаг воспаления и под влиянием IFN-I (IFNα и IFNβ) активируются и синтезируют IFNγ. Секреция IFNγ привлекает и активирует NK-клетки и цитотоксические CD8 T-лимфоциты, которые способны распознавать (при наличии специфических рецепторов) и уничтожать инфицированные клетки. В ходе развития реакций врожденного иммунитета развивается секреция IFNγ из нейтрофилов периферической крови, увеличивается функциональная активность цитотоксических клеток.

Ряд экспериментальных данных свидетельствуют о способности MAVS увеличивать свой уровень экспрессии, усиливать синтез противовирусных и провоспалительных цитокинов, а также индуцировать апоптоз [8]. В свою очередь, контактные взаимодействия активированных нейтрофилов с инфицированными вирусами клетками, развивающими апоптоз, вызывают формирование нейтрофильных экстраклеточных сетей с последующим фагоцитозом и гидролизом всех внутриклеточных компонентов инфицированных клеток, включая вирусные ДНК или РНК [3, 9].

Представленные данные позволяют предположить, что в организме действует неспецифическая система противовирусной защиты, связанная с образованием НЭЛ. Ключевой сенсор этой системы — мембранный белок MAVS, локализованный на наружной митохондриальной мембране. Присоединение к нему вирусной ДНК или РНК вызывает определенные конформационные изменения, которые через ряд этапов индуцируют запуск апоптоза инфицированной клетки. Контактные взаимодействия нейтрофилов с инфицированной клеткой, находящейся в состоянии апоптоза, вызывает раскрытие НЭЛ, которые обеспечивают захват апоптозирующих клеток, фагоцитоз и гидролиз всех клеточных и вирусных структур.

Роль НЭЛ в регуляции иммунного ответа

Формирование НЭЛ при взаимодействии с патогеном происходит при достижении необходимого уровня активации нейтрофилов, в ходе которой экспрессируется геном, синтезируются ферменты противоинфекционной защиты, развивается синтез цитокинов и синтезируются регуляторные белки, к которым относится Toll-взаимодействующий белок. Toll-взаимодействующий белок (Toll-interacting protein, Tollip) представляет собой убиквитинсвязывающий белок, который регулирует (ограничивает) врожденный иммунный ответ, включая передачу сигналов Toll-подобных рецепторов, является ключевым негативным регулятором врожденного иммунитета, предотвращающим чрезмерные воспалительные реакции. Его роль исследовали на примере больных с различными заболеваниями и в экспериментальных моделях на животных. При обследовании больных с тяжелым воспалением, таким как септический колит с неблагоприятным клиническим исходом, нашли сниженные уровни Tollip в периферической крови по сравнению с уровнем Tollip в крови здоровых доноров. Такие Tollip-дефицитные нейтрофилы обладали сниженной миграционной способностью по отношению к сильному хемоаттрактанту N-формил-Мет-Лей-Фен — продукту деградации бактериальных белков, обладали ослабленным потенциалом генерации НЭЛ и демонстрировали пониженную активность в бактериальном уничтожении [10]. Дефицит Tollip связан с повышенным риском развития туберкулеза. У обследованных больных нашли полиморфизмы Tollip, что указывает на механизм негативной регуляции передачи сигналов TLR в патогенезе туберкулеза человека [11].

Дефицит Tollip в организме вызывает ускоренное включение адаптивной иммунной системы в ответную реакцию. Tollip-дефицитные нейтрофилы значительно увеличивали активацию Т-клеток за счет усиления экспрессии костимулирующей молекулы CD80 и снижения экспрессии ингибирующей молекулы PD-L1. Отсутствие Tollip в организме увеличивало образование STAT5 и уменьшало образование STAT1 — факторов транскрипции, которые ответственны за экспрессию CD80 и PD-L1 соответственно [12]. Приведенные данные показывают важную роль Toll-взаимодействующего белка в реакциях врожденного иммунитета. По мере раскрытия НЭЛ Tollip подавляет экспрессию TLR-рецепторов, ограничивая взаимодействие нейтрофилов с патогеном. Формирование НЭЛ при этом замедляется, что, очевидно, представляет собой механизм ограничения врожденного иммунитета на ранних стадиях развития воспаления. Нарушение этого процесса влечет за собой продолжительный выход ферментов, активных форм кислорода, биологически активных веществ из раскрытых НЭЛ и вызывает повреждение ткани.

Таким образом, физиологическое значение Toll-взаимодействующего белка заключается в поддержании баланса между реакциями врожденного и адаптивного иммунитета. Другими важными факторами, влияющими на формирование иммунитета, являются ферменты, образующиеся при активации НЭЛ.

Главные секретируемые ферменты, которые поступают в очаг воспаления при раскрытии НЭЛ, это NADPH-оксидаза, миелопероксидаза и аргиназа. Физиологическое значение NADPH-оксидазы и миелопероксидазы состоит в генерации радикалов кислорода и азота в очаге воспаления, которые обладают выраженным противоинфекционным действием. Роль аргиназы состоит в ингибировании адаптивного иммунитета [13]. В большом количестве исследований показано, что на ранних этапах воспаления эти предварительно активированные ферменты поступают во внеклеточное пространство и нарушение этого процесса всегда вызывает неблагоприятные последствия. Результаты исследований показывают, что это абсолютно необходимый этап при взаимодействии патогена с иммунной системой организма. Необходимо отметить, что данный этап ограничен по времени. Физиологическим ограничителем этапа формирования НЭЛ является Toll-взаимодействующий белок. Значение аргиназы, поступающей в очаг воспаления из активированных нейтрофилов в ходе формирования НЭЛ, и вызванное этим ингибирование адаптивного иммунитета не вполне ясны и привлекают внимание исследователей.

При исследовании больных острым ишемическим инсультом нашли взаимосвязь между активностью аргиназы крови, отношением нейтрофилы/лимфоциты и тяжестью заболевания. А при исследовании больных с черепно-мозговой травмой (через 24 ч после травмы) в их крови обнаружено увеличение количества матричной РНК аргиназы 1,
а также растворимой формы поверхностного рецептора CD100, локализованного на эндотелиальных клетках, что свидетельствует об активации нейтрофилов и вовлечении в воспалительный процесс сосудистого эндотелия. Кроме этого, в крови больных было повышено содержание матриксной металлопротеиназы 9, участвующей в ремоделировании внеклеточного матрикса, и фактора миелоидной дифференцировки 2 — гликопротеина, который связывается с внеклеточным доменом рецептора врожденного иммунитета (TLR4), вызывает его активацию и играет важную роль во врожденном иммунитете [14, 15]. Острый инсульт изменяет системный иммунный ответ в периферической крови, однако молекулярный механизм, с помощью которого при этом усиливается экспрессия аргиназы, не ясен. Исследование пациентов с острым ишемическим инсультом показало, что микроРНК miR-340–5p связывается с 3’-нетранслируемой областью гена аргиназы 1 и подавляет экспрессию
гена аргиназы. Предполагают, что снижение содержания miR-340–5p, обнаруженное у больных с острым инсультом, снимает торможение экспрессии гена аргиназы 1, что вызывает впоследствии ее интенсивный синтез [16]. Используя модель временной окклюзии средней мозговой артерии у мышей, обнаружили способность мышиных нейтрофилов высвобождать аргиназу из предварительно сформированных гранул. При этом наблюдали снижение экспрессии дзета-цепи (CD3ζ) на Т-лимфоцитах, что согласуется со снижением их функциональной активности [17].
Острые инфекционные процессы вызывают быстрое увеличение активности аргиназы в периферической крови пациентов. При исследовании некротического энтероколита у детей нашли значительное увеличение активности аргиназы периферической крови и продемонстрировали, что этот фермент секретируют инфильтрирующие нейтрофилы [18]. Во время острой инфекции у людей обнаружили, что численность нейтрофилов периферической крови, синтезирующих аргиназу, пропорциональна тяжести заболевания. Эти нейтрофилы нарушают экспрессию дзета-цепи CD3-клеток и функцию Т-лимфоцитов, способствуя дисфункции Т-клеток, наблюдаемой при сепсисе [19, 20]. Хронизация воспаления также сопровождается повышением активности аргиназы в очаге воспаления. В туберкулезных гранулемах, которые представляют собой компактные, организованные скопления инфицированных и неинфицированных макрофагов, Т-клеток, нейтрофилов и других клеток, выявлена повышенная активность аргиназы, причем источником этого фермента служат макрофаги. Индукция аргиназы блокирует пролиферацию Т-клеток, лишая их функциональной активности [21].

Полученные данные в их совокупности заставляют утверждать, что взаимодействие врожденного и адаптивного иммунитета испытывает определенные реципрокные отношения в начальный период острого воспаления. Эти же данные свидетельствуют об ингибировании адаптивного иммунитета в начальный период острого воспаления, сопряженного с формированием НЭЛ. На этапе формирования ловушек во внеклеточную среду поступает аргиназа, происходит локальное снижение концентрации аргинина, что влечет за собой ингибирование функциональной активности Т-лимфоцитов и торможение процессов презентации антигенов. На этом этапе происходит выраженная активация врожденного иммунитета, которая сопряжена с одновременным ингибированием адаптивного иммунитета. По мере ослабления экспрессии рецепторов врожденного иммунитета, под влиянием Toll-взаимодействующего белка, реактивность системы врожденного иммунитета снижается. Презентация антигенов на фоне отсутствия выхода аргиназы из нейтрофилов создает условия для активации адаптивного иммунитета.

Заключение

Анализ приведенного экспериментального материала позволил обратить внимание на ранее неизвестные эффекты НЭЛ. Продемонстрирована их важная роль в формировании противовирусного иммунитета, а также их участие в регуляции врожденного и адаптивного иммунитета.

В начальный период острого инфекционного воспаления развивается активация нейтрофилов, индуцированная патогеном. На этом этапе нейтрофилы синтезируют и секретируют IFNγ, а также активируют синтез NADPH-оксидазы, миелопероксидазы и аргиназы. Достижение определенного высокого уровня активации NADPH-оксидазы запускает формирование НЭЛ, которые связывают, инактивируют или повреждают патогены за счет действия активных форм кислорода и азота. На этапе раскрытия ловушек во внеклеточную среду поступает аргиназа, происходит локальное снижение концентрации аргинина, что влечет за собой торможение функциональной активности Т-лимфоцитов. В дальнейшем развитие острого инфекционного воспаления сопровождается снижением экспрессии TLR-рецепторов под влиянием Toll-взаимодействующего белка, и раскрытие НЭЛ ограничивается. Увеличение функциональной активности Т-лимфоцитов на фоне отсутствия выхода аргиназы из нейтрофилов создает условия для активации адаптивного иммунитета.

Сведения об авторах:

Казимирский Александр Николаевич — д.б.н., доцент, ведущий научный сотрудник отдела молекулярных технологий, ORCID iD 0000-0002-3079-4089;

Салмаси Жеан Мустафаевич — д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патофизиологии и клинической патофизиологии, ORCID iD 0000-001-8524-0019;

Порядин Геннадий Васильевич — д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, кафедра патофизиологии и клинической патофизиологии, ORCID iD 0000-0003-2010-3296.

ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. 117997, Россия, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Контактная информация: Казимирский Александр Николаевич, e-mail: alnica10@mail.ru. Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. Конфликт интересов отсутствует. Статья поступила 24.01.2020.

About the authors:

Aleksandr N. Kazimirskii — PhD (Biology), Associate Professor, leading researcher of the Division of Molecular Technologies, ORCID iD 0000-0002-3079-4089;

Jean M. Salmasi — MD, PhD, Professor, Head of the Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, ORCID iD 0000-001-8524-0019;

Gennadiy V. Poryadin — MD, PhD, Professor, Corresponding Member of RAS, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, ORCID iD 0000-0003-2010-3296.

Pirogov Russian National Research Medical University. 1, Ostrovityanov str., Moscow, 117437, Russian Federation.

Contact information: Aleksandr N. Kazimirskii, e-mail: alnica10@mail.ru.

Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned. There is no conflict of interests. Received 24.01.2020.