Оценка эффективности интерферона альфа-2b в комбинации с
антиоксидантами в отношении вируса гриппа птиц A (H7N9) in vitro

П. Г. Дерябин, доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН
Г. А. Галегов, доктор медицинских наук, профессор
ФГБУ ФНИЦЭИМ им. Н. Ф. Гамалеи МЗ РФ, Москва

Известно, что вирусы способны к фенотипической и генотипической изменчивости
и постоянно формируют опасные для человеческой популяции варианты. Наибольшую
проблему с точки зрения эпидемиологии представляет собой изменчивость вирусов
гриппа [4]. Одним из механизмов формирования новых вариантов вируса гриппа
является формирование реассоциатов в результате смешанного заражения. Наиболее
частым источником образования новых вариантов вируса гриппа А являются
водоплавающие и другие птицы [1, 4].

В настоящий момент Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) зафиксированы
несколько вариантов вирусов гриппа птиц, способных инфицировать человека: штаммы
вируса гриппа птиц А (H5N1) и A (H7N9) [1]. Впервые о заражении гриппом птиц A
(H7N9) человека было сообщено 31 марта 2013 г. органами здравоохранения Китая,
на сегодняшний день в ВОЗ поступили сообщения о 453 лабораторно подтвержденных
случаях инфицирования людей вирусом птичьего гриппа A (H7N9), полученные от
Национальной комиссии по здравоохранению и планированию семьи КНР, от
Гонконгского Центра по охране здоровья и от Центров контроля заболеваний Тайбэя
[1].

Несмотря на незначительное количество сообщений о заражении данным вирусом
человека, вирус гриппа птиц A (H7N9) вызывает у врачей обеспокоенность в связи с
тем, что у большинства пациентов заболевание протекало в тяжелой форме и в 175
случаях имело летальный исход [1]. Таким образом, своевременный поиск способов
лечения данной инфекции является актуальной задачей.

Химиопрепараты против вируса гриппа представлены соединениями, оказывающими
свое воздействие на разные стадии репликации вируса гриппа: препараты
ремантадина блокируют белок М2 вируса гриппа. Препараты занамивир и осельтамивир
действуют как ингибиторы нейраминидазы. В отношении препаратов группы
ремантадина можно отметить их высокую токсичность и низкую эффективность, так
как они активны только в отношении гриппа А, но не против гриппа В. Ингибиторы
нейраминидазы являются эффективными препаратами, но, имея высокую стоимость,
менее доступны для населения.

В организме человека основной системой, ответственной за борьбу с вирусными
инфекциями, является система интерферона. В арсенале современной медицины
имеются препараты рекомбинантного интерферона альфа-2b, широкий спектр
противовирусной активности которых характеризован в многочисленных исследованиях
как in vitro, так и in vivo [5].

По данным различных исследователей эффективность терапии интерфероном
альфа-2b вирусных инфекций можно значительно повысить при помощи антиоксидантов
[2, 3, 7, 8]. Впервые о синергизме интерферона альфа-2b и антиоксидантов в
терапии вирусных инфекций сообщалось в работах В. В. Малиновской. По данным [7,
8] комбинация интерферона альфа-2b и антиоксидантов iv vitro и in
vivo имеет выраженный синергидный эффект: в присутствии антиоксидантов
специфическая противовирусная активность интерферона увеличивается в несколько
раз, что позволяет не только повысить эффективность терапии, но и снизить
возможность проявления побочных эффектов.

Целью настоящей работы явилось изучение противовирусной активности
интерферона альфа-2b как противовирусного препарата в отношении вируса гриппа
птиц A (H7N9) и оценка влияния антиоксидантов на течение экспериментальной
инфекции in vitro.

Материалы и методы исследования

Культура клеток

Линия клеток почки зеленой мартышки Vero клон Е6, получена из лаборатории
культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Культуру клеток
выращивали в виде монослоя в 96-луночных планшетах при 37 °С в атмосфере 5% СО₂
с использованием среды Игла МЕМ с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл
пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 150 мкг/мл и 10% сыворотки
крови эмбрионов коров (ростовая среда). В качестве поддерживающей использовали
среду Игла с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50
МЕ/мл), глутамина 150 мкг/мл и 2% инактивированной при 56 °С сыворотки крови
эмбрионов коров.

Вирус

Штамм вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) получен из лаборатории
Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского.
Для культивирования использовали алантоисную полость 9–10-дневных куриных
эмбрионов.

Препараты

• Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, Р N003726/01,
  производства ООО «Фармапарк», Россия, активность 4 × 10⁸ МЕ/мл.
  Обладает выраженной противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей
  активностью. В качестве референса активности интерферона альфа-2b
  человеческого рекомбинантного использовали международный стандарт активности
  интерферона (International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566).
• Аскорбиновая кислота (витамин С), ЛС-000420, производства «ДСМ Нутришнл
  Продактс (ЮК) Лимитед», Великобритания. Является высокоактивным природным
  антиоксидантом, нейтрализует свободные радикалы, обладает способностью
  восстанавливать активную форму витамина Е.
• Аскорбат натрия, ЛС-000423, производства «ДСМ Нутришнл Продактс (ЮК)
  Лимитед», Великобритания. Является натриевой солью аскорбиновой кислоты, имеет
  аналогичную биологическую активность с аскорбиновой кислотой, но в отличие от
  нее обладает меньшим поверхностным раздражающим действием.
• Альфа-токоферола ацетат (витамин E), dl-альфа-токоферола ацетат, тип CWS/F500,
  водорастворимая форма, производства Sigma Aldridsch, США. Является
  высокоактивным природным антиоксидантом и антигипоксантом, нейтрализует
  свободные радикалы и перекиси жирных кислот, активные формы кислорода,
  способен предотвращать перекисное окисление мембран клеток.
• Мексидол (этилметилгидроксипиридина сукцинат), P N002161/01, производства
  ООО «НПК Фармасофт», Россия. Является высокоактивным синтетическим
  антиоксидантом, нейтрализует свободные радикалы.

Цитотоксичность

Оценку цитотоксичности препаратов проводили по стандартной методике [6] путем
инкубации 1-суточного монослоя клеточной культуры Vero клон Е6 с различными
концентрациями препаратов в течение 72 часов в 96-луночных планшетах при 37 °С в
атмосфере 5% СО₂. После инкубации клетки отмывали раствором Хенкса,
для подсчета количества клеток использовали автоматический счетчик клеток
Cauntess, производства Invitrogen, США с применением 0,4% раствора трипанового
синего. За ЦД50 (50% тканевая цитопатическая доза) испытуемого образца принимали
максимальную концентрацию, способствующую выживанию не менее 50% клеток по
сравнению с контролем. За МПК (максимально переносимая концентрация) испытуемого
образца принимали максимальную концентрацию испытуемого образца, не вызывающую
видимых изменений в жизнеспособности клеток.

Антивирусная активность

Антивирусную активность оценивали по уровню подавления цитопатического
действия вируса различными разведениями препаратов и комбинаций на культуре
клеток Vero клон Е6. Для работы использовали 1-суточный монослой культуры,
выращенный в 96-луночных планшетах. Множественность инфицирования вируса гриппа
птиц A/Anhui/2013 (H7N9) составила 0,1 ТЦД₅₀ на клетку,
продолжительность инкубации 48 часов при 37 °С в атмосфере 5% СО₂. За
ИК₅₀ (50% ингибирующая концентрация) принимали концентрацию
испытуемого образца, при которой клеточная культура оказалась полностью
защищенной от цитопатического действия вируса в 50% лунок.

Результаты и обсуждение

Изучение цитотоксического действия препаратов

Определенные максимальные переносимые концентрации препаратов, не оказывающие
цитотоксического действия на культуру клеток Vero клон Е6, приведены в табл. 1.

Для работы на культуре клеток при определении антивирусной активности
использовали концентрации препаратов меньше или равные МПК, указанные в табл. 1.

Изучение антивирусной активности препаратов

Определенные для препаратов ИК₅₀ в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013
(H7N9) представлены в табл. 1. Для оценки возможной перспективы использования
препарата в качестве химиотерапевтического средства в отношении вирусной
инфекции использовали понятие ХТИ (химиотерапевтический индекс) — отношение
максимально переносимой концентрации препарата к ИК₅₀. Для
эффективных противовирусных препаратов величина ХТИ должна быть более 3.
Полученные данные в отношении антивирусной активности исследуемых препаратов
показывают, что интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный может быть
использован в качестве средства противовирусной терапии инфекции, вызываемой
вирусом гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9). Также показано, что антиоксидант
Мексидол обладает слабовыраженной противовирусной активностью со значением ХТИ
4,0.

Изучение антивирусной активности комбинаций препаратов

Для изучения влияния антиоксидантов на антивирусную активность интерферона
альфа-2b готовили растворы исследуемых препаратов с различной концентрацией как
интерферона альфа-2b, так и антиоксидантов. Для оценки эффективности комбинации
использовали понятие фракционного ингибирующего коэффициента (ФИК), значение
которого вычисляли по формуле (ИД50 — 50% ингибирующая доза):

При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении
ФИК, равном 1,0–1,5, имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК
более 2 имеет место антагонизм соединений [9]. Результаты оценки влияния
антиоксидантов на антивирусную активность интерферона альфа-2b приведены в табл.
2.

Из представленных данных видно, что антиоксиданты оказывают стимулирующее
действие на противовирусную активность интерферона альфа-2b: в присутствии
разных концентраций антиоксидантов ИК₅₀ интерферона альфа-2b
снижается в 2 и более раза. Так, например, в присутствии аскорбиновой кислоты в
концентрации 25 мкг/мл ИК₅₀ интерферона альфа-2b снижается в 8 раз,
при использовании концентрации 2,5 мкг/мл — в 2 раза. В присутствии аскорбата
натрия в концентрации 25 мкг/мл ИК₅₀ интерферона альфа-2b снижается в
8 раз, при использовании концентрации 2,5 мкг/мл — в 4 раза. При использовании
альфа-токоферола ацетата в концентрации 25 мкг/мл и 2,5 мкг/мл ИК₅₀
интерферона альфа-2b снижается в 8 раз. При совместном использовании с
Мексидолом в концентрации 25 мкг/мл ИК₅₀ интерферона альфа-2b
снижается в 8 раз, при использовании в концентрации 2,5 мкг/мл — в 4 раза.

При анализе эффекта комбинированного применения антиоксидантов и интерферона
альфа-2b путем расчета ФИК получены данные, демонстрирующие явно выраженный
синергидный эффект для всех комбинаций, причем максимальный синергидный эффект
наблюдали при комбинировании с альфа-токоферола ацетатом. Чуть менее выраженный
синергидный эффект наблюдали при совместном применении интерферона альфа-2b и
аскорбиновой кислоты, наименее выраженный синергизм наблюдали для комбинации
интерферона альфа-2b и Мексидола.

Выводы

Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный является эффективным
препаратом в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9), значение
химиотерапевтического индекса препарата равно 16. Применение интерферона
альфа-2b в комбинации с антиоксидантами повышает его эффективность в отношении
вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) в 8 раз, до величины
химиотерапевтического индекса 128.

Литература

1. Бюллетень ВОЗ «WHO RISK ASSESSMENT. Human infections with avian influenza
   A (H7N9) virus» от 02.10.2014 г.
2. Васильев А. Н. Оценка влияния антиоксидантов на специфическую
   противовирусную активность интерферона алфьа-2 b человеческого рекомбинантного
   в отношении вируса простого герпеса в культуре клеток // Антибиотики и
   химиотерапия. 2010. № 7. С. 20–25.
3. Васильев А. Н., Дерябин П. Г., Галегов Г. А. Протвовирусная
   активность антиоксидантов и их комбинаций с интерфероном альфа-2b человеческим
   рекомбинантным в отношении вируса гриппа птиц А/H5N1 // Цитокины и воспаление.
   2011. Т. 10. № 2. С. 32–36.
4. Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология,
   профилактика, диагностика и терапия / Под ред. О. И. Киселева, И. Г. Маринича,
   А. А. Сомининой. Монография. СПб, 2003, 244 с.
5. Ершов Ф. И., Киселев О. И. Интерфероны и их индукторы (от молекул
   до лекарств). М., 2005. 368 с.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
   фармакологических веществ / Под ред. Р. У. Хабриева. М., 2005.
7. Темичева Е. В., Малиновская В. В., Манахова Л. С. и др. //
   Вопросы вирусологии. 1986. № 1. C. 12–18.
8. Темичева Е. В. Интерфероновый статус при рецидивирующем герпесе
   гениталий и коррекция его нарушений. Автореф. дисс. … канд. мед. наук. М.,
   1989.
9. De Clercq E., Sakuma T., Baba M., Pauwels R., Balzarini J., Rosenberg
   I., Holý A. Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of
   purine and pyrimidines // Antiviral research. 1987. Vol. 8. № 5–6. Р. 261–272.

Статья опубликована в журнале

Лечащий Врач