ВОЗДЕЙСТВИЕ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ И ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗЛАГАЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ В СЕРО-БУРОЙ ПОЧВЕ | Опубликовать статью РИНЦ

ВОЗДЕЙСТВИЕ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ И ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗЛАГАЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ В СЕРО-БУРОЙ ПОЧВЕ

Научная статья

Гасанова У.О. *

ORCID: 0000-0002-2490-8940,

Университет Одлар Юрду, Баку, Азербайджан

* Корреспондирующий автор (ismaylovn[at]mail.ru)

Аннотация

Научная статья посвящена выяснению воздействия свежего нефтяного загрязнения (месторождения Сураханы) на динамику микробиологических процессов в почве, в том числе на целлюлозоразлагающих микроорганизмов. Чтобы понять каким образом это происходит и какие факторы на это влияют, проведен полевой мониторинг загрязненного участка, который показал, что глубина проникновения сырой нефти составила до 12-13 см. Результаты химического анализа отобранных проб почв показали, что содержание нефти в почве составляло 2,1 г/100 г почвы. Также определяли численность микроорганизмов на МПА (мясо пептонный агар), способных разлагать углеводороды (на примере н-гексадекана), численность целлюлолитических микроорганизмов на среде Гетчинсона, степень фитотоксичности (по прорастанию семян кресс-салата), а также степень загрязнения почвы нефтью. Исследовали потребление нефти и нефтепродуктов культурой ЦРМ. Выявлено, что после загрязнения нефтью обнаруживается тенденция снижения общей численности микроорганизмов, растущих на МПА (гетеротрофных групп микроорганизмов) и целлюлозоразлагающх микроорганизмов на фоне роста численности углеводород окисляющих микроорганизмов. Рассмотрено разложение целлюлозы различными культурами ЦРМ и выявлено, что наиболее высокой активностью к разложению целлюлозы обладала культура, выделенная из целинных типов экотопов (территория Джейранбатанского водохранилища). В другой серии модельных экспериментов изучали воздействие биопрепарата на основе ассоциативных полифункциональных бактерий №2, №7, №23 на биогенность нефтезагрязнённой почвы и интенсивность разложения нефти. Задача эксперимента состояла в проведении испытания штаммов целлюлолитических бактерий, которые подтвердили эффективность инокуляции семян высших растений, что создает научную базу создания бактериальных удобрений с использованием целлюлолитических бактерий. Эти биопрепараты могут быть очень эффективны при разработке технологий фиторемедиации нефтезагрязнённых серо-бурых почв.

Ключевые слова: Апшеронский полуостров. серо-бурая почва, нефтяное загрязнение, активность микроорганизмов, целлюлолитические микроорганизмы, ферментативная активность, ремедиация почв. 

INFLUENCE OF OIL POLLUTION ON ENZYME ACTIVITY AND CELLULOSE-DECOMPOSING MICROORGANISMS IN GRAY-DRILLED SOIL

Research article

Gasanova U.O. *

ORCID: 0000-0002-2490-8940,

Odlar Yurdu University, Baku, Azerbaijan

* Corresponding author (ismaylovn[at]mail.ru)

Abstract

This scientific article is devoted to the study of the impact of fresh oil pollution (Surakhani deposits) on the dynamics of microbiological processes in the soil, including cellulose-decomposing microorganisms. In order to understand how this happens and what factors affect it, a field monitoring of the contaminated site was conducted, it showed that the depth of penetration of crude oil was up to 12-13 cm. The results of chemical analysis of soil samples showed that the oil content in the soil was 2,1 g/100 g of soil. The number of microorganisms per MPA (meat-and-peptone agar) capable of decomposing hydrocarbons (using n-hexadecane), the number of cellulolytic microorganisms in Getchinson’s medium, the degree of phytotoxicity (germination of watercress seeds), and the degree of soil pollution by oil were also determined. The authors investigated the consumption of oil and petroleum products by CDM culture. It was revealed that after oil pollution there is a tendency to reduce the total number of microorganisms growing on MPA (heterotrophic groups of microorganisms) and cellulose-decomposing microorganisms against the background of the increase in the number of hydrocarbons of oxidizing microorganisms. The decomposition of cellulose was considered by various cultures of CDM, and it was revealed that the culture isolated from virgin types of ecotopes (the territory of the Dzheyranbatan reservoir) had the highest activity for the decomposition of cellulose. In another series of model experiments, the effect of a biopreparation based on associative polyfunctional bacteria No. 2, No. 7, No. 23 on the biogenicity of oil-contaminated soil and the intensity of oil decomposition was studied. The task of the experiment was to test cellulolytic bacterial strains, which confirmed the effectiveness of inoculation of seeds of higher plants, and that creates the scientific basis for the creation of bacterial fertilizers using cellulolytic bacteria. These biological products can be very effective in the development of technologies for phytoremediation of oil-contaminated gray-brown soils.

Keywords: Absheron peninsula, gray-brown soil, oil pollution, microorganism activity, cellulolytic microorganisms, enzymatic activity, soil remediation.

Введение

Почва является центром связи всей биосферы. Именно в почве наиболее интенсивно протекают основные процессы обмена вещества и энергии между корой земли, атмосферой, гидросферой и функционирующими на суше живыми организмами. Именно это определяет экологическую роль почвенного покрова и актуальность проведения почвенного мониторинга, которая является важной частью общего мониторинга окружающей среды [3]. Почвенный экологический мониторинг представляет собой разработанную систему контроля качества почвенного покрова, не ограниченного в пространстве и времени, которая обладала бы способностью дать максимально полную информацию об их состоянии, с тем, чтобы адекватной оценки прошлого, настоящего и прогноза его изменения в будущем. Почвенный мониторинг в настоящее время является одной из наиважнейших составляющих экологического мониторинга.  Его основная задача – выявление качественных и количественных изменений почвенного покрова, которые в конечном итоге потенциально могут нанести вред качеству жизни человека.

В данной статье в качестве объектов исследования служили образцы почв, которые были отобраны на Апшеронском полуострове в районе Джейранбатан. Цель нашего исследования – выделить и изучить целлюлозоразлагающие микроорганизмы в ходе нефтяного загрязнения (месторождения Сураханы).

Материалы и методы

Нами методом моделирования проведен лабораторный и полевой эксперимент с целью изучить воздействие свежего нефтяного загрязнения на динамику микробиологических процессов в серо-бурой почве, в том числе на целлюлозоразлагающие микроорганизмы.

В лабораторном эксперименте чистая почва, отобранная с целинной почвы (район расположения Джейранбатан) загрязнялась сырой нефтью (месторождения Сураханы) в концентрации 0,1,0,5, 0,8, 1,0, 1,5, 2,0, 5,0%.   Вес почвы для эксперимента- 1,0кг.  В качестве контроля использовали почву не загрязненную.  После загрязнения почвы оставляли при комнатной температуре в течение 90 дней. Влажность в почве поддерживали на уровне 55-60% от полной полевой влагоемкости. Рыхление не проводили. Через 90 дней во всех вариантах почв проводили микробиологический анализ. Определяли общую численность микроорганизмов (на МПА), микроорганизмов, способных разлагать углеводороды (на примере н-гексадекана), численность целлюлолитических микроорганизмов (на среде Гетчинсона) и фитотоксичность почв (по прорастанию семян ячменя).

Статическая обработка результатов производилась с применением программ Statistica V6.0 для Windows, Ехсеl – 2003. При оценке статической достоверности средних полученных данных использовали t – критерий Стьюдента. Представление результатов в таблицах и графиках: среднее стандартное отклонение.

Результаты и их обсуждение

Результаты представлены в табл.1.

Как видно из данных табл.1, при загрязнении почвы сырой нефтью через 90 дней экспозиции обнаруживается тенденция снижения общей численности микроорганизмов, растущих на МПА (гетеротрофных групп микроорганизмов) и целлюлозоразлагающих микроорганизмов на фоне роста численности углеводород окисляющих микроорганизмов, а также повышения степени фитотоксичности почв. Таким образом, несмотря на то, что почва была отобрана с целинных экотопов, содержащих в своем составе растительные остатки, нефтяное загрязнение почв существенно снижает численность целлюлозоразлагающих микроорганизмов, что свидетельствует об угнетающем воздействии углеводородов на эти группы микроорганизмов.

 

Таблица 1 – Динамика изменения численности различных групп микроорганизмов в нефтезагрязнённой серо-бурой почве

В полевом модельном эксперименте нами на целинном участке (в районе расположения Джейранбатанского водохранилища) был выбран участок площадью 0,5м².   На эту площадь было равномерно по поверхности внесено 2л сырой нефти (месторождения Сураханы).  Начало эксперимента- 11 мая 2017г.  в качестве контроля был участок, располагавшийся на расстоянии 10 м от модельного, загрязненного.  Через 4 месяца с экспериментального и контрольного были отобраны образцы почв с горизонта 0-10см и в лабораторных условиях проведены микробиологические анализы. Определяли общую численность микроорганизмов (на МПА), микроорганизмов, способных разлагать углеводороды (на примере н-гексадекана), численность целлюлолитических микроорганизмов (на среде Гетчинсона), степень фитотоксичности (по прорастанию семян кресс-салата), а также степень загрязнения почвы нефтью. Полевой мониторинг загрязненного участка показал, что глубина проникновения сырой нефти составила до 12-13см.  Результаты химического анализа отобранных проб почв показали, что содержание нефти в почве составляло 2,1г/100г почвы. Результаты приведены в табл. 2.

 

Таблица 2 – Численность различных групп микроорганизмов в нефтезагрязненной серо-бурой почве

№№ пп.	Вариант опыта	Биологическая активность почв			Фитотоксич-ность почв, % прорастания семян
		Численность м-ов на МПА, КОЕ/на г почвы	Численность  углеводород-окисляющих, КОЕ/на г почвы	Числен-ность ЦРМ, КОЕ/тыс.на г почвы
1	Чистая почва	2,9.107	1.0.105	27,9	100
2	2,1% загрязнение	5,2.106	6,2.105	14,8	32

 

Как видно из данных табл.2, при загрязнении почвы сырой нефтью через 4 месяца после загрязнения обнаруживается тенденция снижения общей численности микроорганизмов, растущих на МПА (гетеротрофных групп микроорганизмов) и целлюлозоразлагающих микроорганизмов на фоне роста численности углеводород окисляющих микроорганизмов.  Таким образом, несмотря на то, что почва относится к целинным экотопам, содержащих в своем составе растительные остатки, нефтяное загрязнение почв существенно снижает численность целлюлозоразлагающих микроорганизмов, что подтверждает   угнетающее воздействие углеводородов на эти группы микроорганизмов. Полученные данные показывают также, что загрязнение почвы нефтью повышает её фитотоксичность-прорастаемость семян кресс-салата снижается на 68% по сравнению с чистой почвой.

Известно, что неспороносные бактерии Ps. fluorescensи Erwiniaherbicolaотносятся к группировке пионеров освоения мертвой растительной органики [8], так как являются наиболее конкурентно-способной группой, благодаря быстрым темпам размножения и возможности существовать за счет легкоподвижных органических веществ, присутствующих в неразложившемся растительном материале [7]. В этой связи в наших исследованиях мы изучали способность 3-х культур, принадлежащих к Ps. fluorescens, выделенных нами из различных почвенных экотопов-целинных (штамм № 2), агрогенных (штамм №7) и техногенных (штамм № 23) разлагать целлюлозу. Опыты проводили на среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой, продолжительность опыта 15 дней. Результаты представлены в табл.3.

 

Таблица 3 – Интенсивность разложения целлюлозы различными культурами ЦРМ

№№ культур, место выделения	Целлюлолитическая активность
	Убыль в массе,г	Убыль в массе,%
2- целинные	10	54
7-агрогенный	8	35
23-техногенный	1	6

 

Результаты определения 3-х штаммов культур   показали, что наиболее высокой активностью к разложению целлюлозы обладала культура, выделенная нами из целинных типов экотопов (территория Джейранбатанского водохранилища). Активность культуры, выделенной из агрогенных почв (территория маслиновой рощи) была несколько ниже- 35%, наиболее низкой целлюлозоразлагающей активностью характеризовалась культура, выделенной из нефтезагрязненного участка (месторождение Сураханы). Таким образом, из выделенных бактериальных культур рода Ps. fluorescens наиболее высокими целлюлозоразлагающими способностями характеризовались культуры, выделенные из незагрязненных серо-бурых почв Апшеронского полуострова.

Интерес представлял выявить отношение выделенных культур к нефти и нефтяным углеводородам. В этой связи нами на жидкой среде Раймонда при непрерывном культивировании изучена углеводородокисляющая способность выделенных 3-х культур Ps. fluorescens. В качестве единственного источника углерода и энергии   при культивировании бактерий использовали сырую нефть (месторождение Сураханы), гексадекан, керосин, дизельное топливо. Интенсивность использование нефтяных углеводородов определяли по оптической плотности биомассы. Результаты представлены на рис.1-3. Как видно, наиболее высокой углеводородокисляющей способностью обладал штамм 23, выделенный из нефтезагрязнённой почвы (на территории НГДУ Сураханы). Сравнительно низкими углеводород окисляющими способностями характеризовались культуры   № 2 и №7, выделенные соответственно из целинных и агрогенных почв.  Это свидетельствует о различии физиологических способностях представителей одного и того же вида ЦРМ по отношению к различным источникам углерода.

 

Рис. 1 – Потребление нефти и нефтепродуктов культурой ЦРМ штамм №23 (выделен из нефтезагрязнённых почв)

Рис. 2 – Потребление нефти и нефтепродуктов культурой ЦРМ штамм №7 (выделен из агрогенных почв)

Рис. 3 – Потребление нефти и нефтепродуктов культурой ЦРМ штамм №2(выделен из целинных почв)

В настоящее время одна из острых экологических проблем Апшеронского полуострова является ремедиация нефтезагрязненных почв [6]. Биотехнологии очистки, основанные на использовании деструкционной активности микроорганизмов, настоящее время считаются наиболее перспективными [2], [10]. В этой связи нами проведены работы по выявлению возможности использования выделенных нами из различных экотопов бактериальных культур, обладающих полифункциональными свойствами – целлюлозо- и углеводород окисляющей способностью в биотехнологии очистки нефтезагрязнённых серо-бурых почв [11].

Сложность биодеструкции нефтепродуктов микроорганизмами, заключается в многокомпонентности и разнородности составляющих их веществ (н- и изо-парафины, моно- и полиароматические углеводороды широкого молекулярного веса), поэтому создание биопрепаратов на основе консорциума микроорганизмов, способных окислять различные классы углеводородов, является предпочтительным для очистки почв. Работы последних десятилетий показали, что повышения эффективности работы биопрепаратов можно достигнуть использованием клеток микроорганизмов- деструкторов, иммобилизованных на различных носителях минерального происхождения, обладающих высокой сорбционной активностью [9]. Это связано с тем, что такое прикрепление создает следующие преимущества для микробных клеток: угли обладают способностью сорбировать нефтяные углеводороды, что облегчает доступ этих веществ к иммобилизованным клеткам, во-вторых, функционирование в сообществе, развивает «чувство кворума» у микробных клеток, сопровождающееся повышением эффективности деструкции углеводородов нефти, а, в-третьих, внесенный минеральный компонент может служить дополнительным источником питательных веществ для микроорганизмов.[4], [5]. Проведение такой операции обеспечивает высокую концентрацию микробных клеток в зоне их действия, предотвращает их вымывание, обеспечивает микробным клеткам защиту от действия высоких концентраций нефти и, вследствие того, что носитель сам сорбирует нефтяные углеводороды, повышается доступность их к ферментативным системам клеток микроорганизмов. Вследствие суммарного действия всех этих факторов, увеличивается удельная специфическая деструктивная активность биокомпозита. Нами для создания биокомплекса в качестве сорбента использовались природные адсорбенты растительного происхождения- древесные опилки, измельченная солома, а также адсорбент минерального происхождения – цеолита -Айдагское месторождение, Азербайджан [1], (рис.4).

Рис. 4 – Образцы цеолита Айдагского месторождения (Азербайджан)

 

На основе трех культур- №2, №7 и №23 создана ассоциация штаммов. Культуры выращивали на среде Раймонда в присутствии н-С₁₆, биомассу выращенных культур отделяли в фазе стационарного роста.   Опыты закладывали в сосудах объёмом 2кг, объём почвы в сосуде 1кг. Навеску почвы, отобранную из целинных участков (территоря Джейранбатанского водохранилища) просеянной через сито 3 мм массой 500 г помещали в вегетационный сосуд, увлажняли водой и вносили последовательно сырую нефть (месторождение Сураханы) в количестве 3% от массы почвы.

Варианты эксперимента включали внесение в загрязненную почву биомассы культур полифункциональных микроорганизмов – №2, 37 и №23, как в отдельности, так и в виде ассоциаций, адсорбированные на носителе- древесных опилках. Длительность вегетационных опытов   составила 90 дней в комнатных условиях при температуре 24⁰С. В процессе культивирования    почву увлажняли.  Через 90 дней в почве определяли остаточное содержание   нефти гравиметрическим методом. Результаты представлены в табл. 4.

 

Таблица 4 – Биогенность серо-бурой почвы и интенсивность разложения нефти при внесении полифункциональных биопрепаратов на основе ЦРМ

Варианты опыта	Содержание нефти, гр/100гр. почвы		Степень очистки, %
	Исходное	Через 90 дней
Почва (контроль)	30,0	27	10
Почва+культура №2	30,0	22	27
Почва+культура №7	30,0	19	37
Почва+культура №23	30,0	15	50
Почва +смесь культур №№2,7,23	30,0	12	60

 

Как видно из данных табл.4, при внесении в почву биомассы как отдельных культур, так и их ассоциаций, в почве интенсивность разложения сырой нефти по сравнению с контролем значительно повышается.  В сравнительном плане наибольшее воздействие на снижение в почве содержания нефти оказывало внесение полифункциональной культуры №23, выделенной из нефтезагрязнённой почвы. Вместе с тем и другие культуры, выделенные из чистых почв, также оказывали положительное воздействие на снижение содержания нефти в почве. Однако внесение в почву ассоциации полифункциональных микроорганизмов в виде биопрепарата, адсорбированного на древесных опилках, по сравнению с другими вариантами повышало интенсивность разложения нефти в почве за три месяца степень очистки составила около 60%, в то время как для отдельных культур эти показатели были в пределах 27-50. В другой серии модельных экспериментов изучали воздействие биопрепарата на основе ассоциативных полифункциональных бактерий №№2, 7 и 23 на биогенность нефтезагрязнённой почвы и интенсивность разложения нефти. Варианты эксперимента включали внесение растительных отходов – опилки древесные и солома, биопрепарата ассоциативных полифункциональных бактерий №№2,7 и 23, адсорбированных на цеолите, а также в виде бактериальной массы.  В чистую почву вносили сырую нефть для достижения интенсивности загрязнения в 3%.  Опилки и солому, предварительно измельченную вносили из соотношения 20гр на 100г почвы и тщательно перемешивали. Опыты ставили в вегетационных сосудах объёмом в 2л, объём почвы в сосуде 1кг.   Биопрепарат на основе ассоциативных культур готовили путем смешивания 2-х суточных культур с природным минеральным адсорбентом цеолитом в соотношении 100г цеолита: 20мл биомассы бактерий с концентрацией клеток КОЕ 10⁷/на 1 мл.  В почву вносили биомассу ассоциативных культур в объёме 20 мл на 1кг. почвы, или биопрепарат в объеме 40г. на 1 кг почвы. Длительность опыта- 90 дней при комнатной температуре около 24⁰С.  В процессе культивирования вегетационные сосуды увлажняли водой.  По окончания 90 дней во всех вариантах определяли общую численность микроорганизмов (сапрофитов на МПА) и содержание остаточной нефти гравиметрическим методом.

 

Таблица 5 – Биогенность серо-бурой почвы и интенсивность разложения нефти при внесении полифункциональных биопрепаратов и растительных материалов

Примечание: АК- ассоциация культур; БП – биопрепарат

 

Как видно из данных табл. 5, внесение в нефтезагрязнённую почву микробных культур как в не адсорбированном, так и виде адсорбированных на носителе способствовало росту биогенности почв и повышало интенсивность разложения в почве нефтяных углеводородов.  Примечательно, что обнаруживается повышение биогенности и степени разложения нефти в почве при внесении в загрязнную почву биопрепарата совместно с источниками целлюлозы. Во всех случаях внесение в почву биопрепарата и органических веществ –  соломы и древесных опилок имело место повышение биогенности и повышение скорости разложения нефти. Это может быть связано с тем, адсорбированне на поверхности цеолита полифункциональных бактерий нивелировало прямое негативное воздействие нефтяных углеводородов на микробные клетки, что способствовало их положительному функционированию в условиях нефтяного загрязнения. С другой стороны, надо принять то, что внесение в почву органических остатков- соломы и древесных опилок способствует улучшению порозности почв, повышают влагоудерживающую способность почв, делают их более структурной, доступа атмосферного кислорода для функционирования микроорганизмов, осуществляющих разложение нефтяных углеводородов.  Поддержание влажности почвы на уровне 50-60% от полной полевой влагоемкости и температура около 25⁰С способствовало высокой скорости разложения в почве нефти.

Исследовали возможность проведения предпосевной обработки семян ячменя целлюлолитическими бактериями №№1,7 и 23, а также их ассоциацией.

 

Таблица 6 – Влияние предпосевной инокуляции целлюлолитическими бактериями на всхожесть семян ячменя

Вариант	Всхожесть семян ячменя, %
Контроль (без инокуляции)	65,0±0,2
Инокуляция штаммом №1	69,3±0,5
Инокуляция штаммом №7	74,5±0,6
Инокуляция штаммом №23	75,3±0,8
Инокуляция  ассоциацией культур	77,8±0,4

 

Как видно из данных табл.6, всхожесть семян ячменя значительно повышается при их предпосевной инокуляции штаммами целлюлолитических бактерий. Так, всхожесть семян, инокулированных перед высевом в почву штаммом №1, составляет 69,3%, всхожесть семян, обработанных штаммом №7, несколько выше -74,5%. Всхожесть семян, обработанных штаммом №23, еще выше -75,3%. Предпосевная обработка семян ячменя ассоциацией этих культур еще более повышает всхожесть семян. В контрольном варианте, где семена высевали без бактеризации, их всхожесть составила только 65,0%. Отмечена видовая специфичность влияния штаммов целлюлолитических бактерий. Так, наиболее благоприятным для инокуляции семян донника оказался штамм №23, который повышал всхожесть семян в среднем на 23% по сравнению с контролем, инокуляция семян ячменя ассоциацией 3-х культур повышает всхожесть по сравнению с контролем на 35%.

В проведенных лабораторных исследованиях данные штаммы как в отдельности, так и в виде ассоциации оказывали положительный эффект на всхожесть семян ячменя, при этом наибольший эффект обнаруживается при воздействии ассоциацией ЦРБ.

Таким образом, проведенные испытания штаммов целлюлолитических бактерий подтвердили эффективность инокуляция семян высших растений, что создает научную базу создания бактериальных удобрений с использованием целлюлолитических бактерий.  Эти биопрепараты могут быть очень эффективны при разработке технологий фиторемедиаци инефтезагрязненных серо-бурых почв.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.