СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТЬ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ DROSOPHILA MELANOGASTER И DROSOPHILA FUNEBRIS С ПОВЫШЕННОЙ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬЮ ЖИЗНИ | Опубликовать статью РИНЦ

СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТЬ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ DROSOPHILA MELANOGASTER И DROSOPHILA FUNEBRIS С ПОВЫШЕННОЙ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬЮ ЖИЗНИ

Научная статья

Булыгин А.А.^1, *, Пастухова Е.И.²

¹ ORCID: 0000-0002-6689-4647;

² ORCID: 0000-0003-4107-5669;

^{1, 2} ФГБОУ ВО Челябинский государственный университет, Челябинск, Россия

* Корреспондирующий автор (skytolya[at]ya.ru)

Аннотация

В данной работе были изучены 14 инбредных линий D. melanogaster и D. funebris, выведенных из природных популяций и доведённых до 12-го поколения. Среди инбредных обнаружилось несколько линий с повышенной продолжительностью жизни. Эти линии затем были дополнительно протестированы на стрессоустойчивость тепловым (39⁰C) и холодовым (-1⁰C) шоком и на изменение массы тела относительно мух диких популяций. В итоге выяснилось, что две линии обладают свойствами, способствующими повышенной продолжительности жизни.

Ключевые слова: инбридинг, инбредная депрессия, долгожительство, стрессоустойчивость, плодовая муха.

STRESS RESISTANCE OF INBRED LINES OF DROSOPHILA MELANOGASTER AND DROSOPHILA FUNEBRIS WITH INCREASED LIFE EXPECTANCY

Research article

Bulygin A.A.^1, *, Pastukhova E.I.²

¹ ORCID: 0000-0002-6689-4647;

² ORCID: 0000-0003-4107-5669;

^{1, 2} FSBEI HE Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia

* Corresponding author (skytolya[at]ya.ru)

Abstract

In this study, 14 inbred lines of D. melanogaster and D. funebris, derived from natural populations and brought to the 12^th generation, were studied. Several lines with increased life expectancy were found among the inbred. These lines were further tested for stress resistance with thermal (39⁰C) and cold (-1⁰C) shock and for changes in body weight relative to flies of wild populations. As a result, it turned out that the two lines have properties that contribute to increased life expectancy.

Keywords: inbreeding, inbreeding depression, longevity, resistance to stress, fruit fly.

Введение

В настоящее время актуальным вопросом науки является изучение биологических механизмов и причин старения организмов. Одним из важнейших объектов биологии и генетики является Drosophila melanogaster. Выявлены различные гены, способные при мутировании существенно изменять продолжительность жизни этого вида [1]. Актуальным вопросом является обнаружение новых генов и сочетаний аллелей, оказывающих влияние на жизнеспособность и продолжительность жизни.

При проведении инбридинга у аутбредных особей могут наблюдаться противоположно направленные тенденции касательно их жизнеспособности и продолжительности жизни: 1) с одной стороны, частым последствием инбридинга является инбредная депрессия, происходящая из-за выхода в гомозиготу рецессивных мутаций или из-за снижения общей гетерозиготности генотипа; 2) с другой стороны в ряде экспериментов обнаружена бо́льшая жизнеспособность потомков нескольких поколений инбридинга [2]. В нашей лаборатории была однажды получена инбредная линия D. funebris с повышенной продолжительностью жизни. Мы решили провести более масштабное исследование по этому поводу. Описанные в этой статье опыты являются продолжением опытов по исследованию инбредных линий из нашей предыдущей статьи [3].

Методы и принципы исследования

Инбредные линии были созданы на основе мух диких популяций, содержащихся в лаборатории кафедры радиационной биологии ЧелГУ на протяжении трёх лет. Для получения нового инбредного поколения самца и самку, отсаживали в пробирку объёмом 15 мл с 5 мл питательной среды стандартного состава [4], смазанной дрожжами. Наркотизация мух проводилась с помощью диэтилового эфира. Инбредные линии удалось вывести с коэффициентом инбридинга от 0,8 до 0,9.

Для опытов на продолжительность жизни девственных мух каждого пола сажали по 5 штук в пробирки того же объёма. Пересадка на новую среду происходила два раза в неделю. D. melanogaster содержались в термостате при постоянном свете и температуре 21⁰C. D. funebris содержались в комнате при температуре 24-25⁰C. Во всех остальных опытах температура находилась в промежутке 24-25⁰C.

В опыте по измерению массы 3-дневные самцы и 5-дневные самки кучками по 8 штук взвешивались на весах с точностью в 0,0001 г.

Для опыта на стрессоустойчивость использовались методы теплового (39⁰C) и холодового (-1⁰C) шока. Во время опыта при 39⁰C записывались времена нокдауна. После термостата или холодильника мух пересыпали в новые пробирки и наблюдали их восстановление. Через сутки считали долю выживших.

Статистическая обработка данных была проведена в программе Past 3.16. Для сравнения кривых выживаемости Каплана-Мейера использовался лог-ранговый тест. Для попарных сравнений масс кучек мух, а также попарных сравнений кривых нокдауна и восстановления использовался U-критерий с поправкой Бонферрони. Различия считались статистически значимыми при p-значении меньшем 0,01.

Основные результаты

По результатам лог-рангового теста кривых выживаемости Каплана-Мейера (табл. 1) для последующих опытов в качестве долгожителей были выбраны линии 3 и 7 у D. melanogaster и 3, 5, 7, 8 у D. funebris.

 

Таблица 1 – Результаты опыта на продолжительность жизни

D. melanogaster
Линия	контроль	1	2	3	6	7	8	9
Самцы
Средняя ПЖ, дни	58	50	41	74	59	73	39	64
р	–	< 10-8	< 10-10	< 0,05	> 0,05	< 0,01	< 10-10	> 0,05
Самки
Средняя ПЖ, дни	51	43	44	59	46	57	51	57
р	–	< 10-3	< 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
D. funebris
Линия	контроль	1	3	5	6	7	8	9
Самцы
Средняя ПЖ, дни	37	23	64	47	27	39	46	31
р	–	< 10-14	< 10-15	< 10-6	< 10-8	> 0,05	< 10-3	< 0,05
Самки
Средняя ПЖ, дни	39	30	60	54	27	53	57	39
р	–	< 10-7	< 10-9	< 10-9	< 10-10	< 10-6	< 10-9	> 0,05

 

Результаты взвешивания мух долгоживущих линий приведены на рисунке 1 (самцы отмечены голубым цветом, самки – розовым, звёздочками отмечены статистически значимые отличия). Единственной линией, масса мух которой значительно ниже контроля, оказалась №3 D. funebris. Линии D. melanogaster не отличились одновременным снижением массы самцов и самок.

 

Рис. 1 – Средняя масса мух долгоживущих линий и 95%-ые доверительные интервалы

 

По результатам опыта на устойчивость к тепловому шоку можно выделить линию №5 D. funebris (рис. 2, 3): самцы этой линии оказались не хуже контроля во времени нокдауна, а самки – лучше контроля как по времени нокдауна, так и по времени восстановления. Опыт по определению времени восстановления самцов D. funebris не удался.

 

Рис. 2 – Средние времена нокдауна (39⁰C)

Рис. 3 – Средние времена восстановления (39⁰C)

 

В опыте на устойчивость к холодовому шоку были проверены только линии D. funebris (рис. 4, табл. 2). Мухи находились при температуре -1⁰C 4 часа. В силу слишком малого времени нокдауна различия между линиями могли быть определены лишь по времени восстановления. Ни одна линия не показали результаты лучше, чем у контроля. Пятая линия оказалась на уровне контроля. Диаграмма для самок выглядит очень похоже на диаграмму для самцов, поэтому на рисунке не изображена.

 

Рис. 4 – Средние времена восстановления самцов линий D. funebris (-1⁰C)

 

Таблица 2 – Показатели восстановления D. funebris после холодового шока

Самцы
Линия	контроль	3	7	8	5
Среднее время восст., мин	17,9	18,2	31,1	30	17,1
p	–	1	<10-17	<10-11	1
Выживаемость	0,72	0,74	0,06	0,79	0,98
Самки
Линия	контроль	3	7	8	5
Среднее время восст., мин	17,8	18,3	29,9	29	17,6
p	–	1	<10-17	<10-10	1
Выживаемость	0,68	0,64	0,09	0,71	0,98

 

Обсуждение

Продолжительность жизни инбредных мух была исследована в очень большом количестве работ. Лучшими, кого удавалось получить в них, были инбредные линии, продолжительность жизни которых была на уровне аутбредных. Такие результаты были получены, например, в работе [5]. В той же работе было показано, что чем ниже температура содержания мух в опыте на продолжительность жизни, тем больше различия между кривыми выживаемости. При переходе от 25⁰C к 21⁰C разница между медианами ПЖ инбредных и аутбредных линий увеличилась в среднем в 1,5 раза. Можно предположить, что в нашем случае выбор температуры 25⁰C вместо 21⁰C для D. melanogaster привёл бы к отсутствию статистически значимых отличий для линий 3 и 7. Но, с другой стороны, возможно, именно пониженная температура позволила их заметить.

Неожиданным результатом является статистически значимое (р<10^-4) увеличение ПЖ самцов линий 3 и 7 D. melanogaster относительно самок, при том, что мухи контрольной линии живут примерно одинаковое время. Это не объясняется стандартными гипотезами о влиянии инбридинга на продолжительность жизни. Во всех изученных нами работах ПЖ самцов инбредных линий не была выше ПЖ самок (например, [6]). Для D. funebris существенных противоречий не наблюдается: контрольные самки и самцы живут примерно одинаковое время, а самки долгоживущих линий живут дольше самцов (p<0,01).

Опубликованных работ по исследованию массы инбредных мух нами найдено не было. В работах по отбору мух по массе тела корреляций с продолжительностью жизни не обнаруживали [7]. Корреляции были обнаружены в опытах по отбору в условиях перенаселения [4]. Но авторы данной работы показывают, что снижение массы и увеличение ПЖ оба являются следствием отбора и не являются причиной одно другого.

Снижение массы тела, а точнее снижение количества клеток в организме, является косвенной причиной увеличения продолжительности жизни при нарушениях инсулинового сигналинга. Речь идёт о пути dInR/dPI3K/dAKT, из-за подавления некоторых генов которого клетки начинают реже делиться. Значительное увеличение ПЖ вызывает, например, подавление гена 14-3-3ε, отрицательного регулятора dFoxO, который сам ингибирует клеточное деление при наличии инсулина [8]. В нашей работе не было никакого отбора по названным выше критериям, поэтому можно предположить, что увеличение ПЖ линии №3 D. funebris сверх нормального уровня произошло из-за избегания инбредной депрессии и дополнительно появления и/или закрепления какой-либо мутации, нарушающей инсулиновый сигналинг.

В исследованиях струссоустойчивости инбредных мух обнаруживали только отрицательное действие инбридинга. Но в работе [9] было получено, что при инбредной депрессии значительное изменение экспрессии в ответ на стресс происходит не более, чем у 200 генов из почти 10 тысяч исследованных. Авторы пришли к выводу, что это подтверждает гипотезу о первоочерёдной роли в инбредной депрессии определённых рецессивных аллелей, а не повышенной гомозиготности генома в целом.

Низкую продолжительность жизни инбредных линий можно восстановить до нормального уровня, изменив экспрессию генов, связанных с ответом на стресс. Такой результат был получен, например, для гена Indy [10]. Для этого же гена показано и увеличение ПЖ сверх нормального уровня. Сверхэкспрессия супероксиддисмутазы приводит лишь к восстановлению ПЖ до нормального уровня у инбредных линий, но не превышению его [11].

Подобные результаты получали и в работах по отбору мух по ПЖ. В работе [12] обнаружили улучшение экспрессии некоторых генов, связанных с ответом на стресс (mthl, Or83b, Gr64a и др). В работе по отбору мух по стрессоустойчивости [13] авторы получили долгоживущих мух 37-го поколения отбора.

Соотнося результаты описанных исследований и наши, мы предполагаем, что линия №5 D. funebris смогла избежать инбредной депрессии и превысила нормальную ПЖ за счёт лучшей стрессоустойчивости. Относительно линии №7 D. melanogaster, самцы которой показали повышенную стрессоустойчивость, а самки – пониженную [3], мы не можем ничего сказать однозначно. Удивительным результатом является и линия №8 D. funebris, показавшая одну из лучших ПЖ, и имеющая одну из худших стрессоустойчивость при нормальной массе. Линии №3 D. melanogaster и №7 D. funebris, имеющие ПЖ, немногим выше контроля, плохие показатели стрессоустойчивости и нормальную массу, скорее всего имеют инбредную депрессию.

Заключение

В данной работе мы подвели итоги нашего исследования инбредных линий D. melanogaster и D. funebris. Из шести инбредных линий с повышенной продолжительностью жизни у двух наблюдалось улучшение показателей, способствующих этому повышению: линия 3 D. funebris отличилась сниженной массой тела, линия 5 D. funebris – повышенной устойчивостью к высоким температурам. Кроме того, ПЖ этих двух линий оказалась не только выше других инбредных, но и выше ПЖ контрольной линии. Мы рассматриваем это как аргумент в пользу гипотез о необязательном вредном влиянии повышенной гомозиготности и о возможности избежать инбредную депрессию. Выведенные инбредные линии могут послужить основой для дальнейших исследований причин долгожительства уже на генном уровне.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.