Современные возможности лабораторной аллергодиагностики | Бала А.М., Клещенко А.Б., Чурсинова Ю.В.

   Введение

    Аллергические заболевания являются глобальной эпидемиологической проблемой во всем мире. По разным данным, 10–30% населения планеты имеют какие-либо проявления аллергических заболеваний, и этот показатель продолжает расти. В этой связи крайне актуальны ранняя диагностика и профилактика аллергических заболеваний [1].
    В развитии аллергических реакций принимают участие в основном иммуноглобулины класса Е (IgE), которые отвечают за проявление аллергии немедленного типа (тип 1, 
IgE-опосредованная гиперчувствительность организма) и выявляются при использовании различных диагностических инструментов [2]. IgE присутствуют в циркуляторном русле человека в чрезвычайно малых количествах. ВОЗ предъявляет к современным тестам определения IgE следующие требования: точность, высокая специфичность и чувствительность, стандартизация и контроль качества при производстве. Автоматические методы исследований предпочтительнее в связи с отсутствием риска персональных ошибок и абсолютной стандартизацией всех параметров технологии. В идеальной методике должна быть исключена вероятность перекрестной реактивности с иммуноглобулинами других классов. Калибровка системы должна соответствовать «золотому стандарту» общего IgE (IgE референс-стандарт 75/502). Согласно требованию ВОЗ, 1 kU/l соответствует 2,4 нг/мл IgE. Особое значение в диагностике аллергии in vivo и in vitro имеет и стандартизация аллергенов в соответствии с позиционным документом, разработанным Международным комитетом по стандартизации аллергенов и кожных тестов (впервые принят на Конгрессе Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (ЕААСI) в 1992 г.), которая относится к международным стандартам ВОЗ. Характеристика аллергенной активности препаратов выражается в международных единицах (International Units, IU) [1].

   Преимущества и недостатки лабораторных методов аллергодиагностики

    При выборе способа обследования пациентов к преимуществам лабораторных методик по сравнению с кожным тестированием можно отнести следующие факты: исследование можно проводить в период обострения заболевания и во всех возрастных группах; отсутствует непосредственный контакт пациента с аллергеном, в связи с чем исключена опасность развития тяжелых аллергических реакций при проведении теста; нет необходимости отменять противоаллергические препараты на период проведения исследования; есть возможность выявления сенсибилизации сразу к большому количеству аллергенов.
    Недостатками тестов in vitro являются несколько обстоятельств: обнаружение специфического IgE (sIgE) к какому-либо аллергену или антигену не доказывает, что именно этот аллерген ответственен за клиническую симптоматику; окончательное заключение и интерпретация лабораторных данных должны быть сделаны только после сопоставления с клинической картиной и результатами развернутого аллергологического анамнеза; титр sIgE не всегда коррелирует с тяжестью симптомов аллергического заболевания; отсутствие sIgE в сыворотке периферической крови не исключает возможности IgE-зависимого механизма, т. к. местный синтез sIgE и сенсибилизация тучных клеток могут происходить и при отсутствии sIgE в кровотоке (например, аллергический ринит); исключительно высокие концентрации общего IgЕ, например у отдельных больных атопическим дерматитом, могут за счет неспецифического связывания с аллергеном давать ложноположительные результаты; идентичные результаты для разных аллергенов не означают их одинакового клинического значения, т. к. способность к связыванию с sIgЕ у разных аллергенов может быть различной.

   Методы диагностики

    Наиболее распространенным методом выявления sIgE к аллергенам является иммуноферментный анализ (ИФА). С помощью ИФА определяется количество sIgE к аллергенам клещей домашней пыли и животных, грибковым, пыльцевым, пищевым и лекарственным аллергенам in vitro в сыворотке крови. В основе метода лежит специфическая реакция антигена и антитела, когда они образуют иммунные комплексы, которые выявляются с помощью фермента в качестве метки для регистрации сигнала, которым предварительно метится один из компонентов (антиген или антитело). Уровни специфического IgE-связывания определяются по интенсивности свечения. Чем сильнее свечение по отношению к негативному контролю (сыворотка, в которой отсутствует sIgE), тем больше sIgE в сыворотке пациента. Концентрация sIgE выражается количественно в международных единицах МЕ/мл.
    Одним из современных методов лабораторной диагностики иммунологического профиля является иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА). В ИХЛА используется иммунологическая реакция, где в качестве субстрата присоединяются люминофоры — вещества, светящиеся в ультрафиолете. Итоги реакции расцениваются по наличию хемилюминесцентного свечения, интенсивность которого пропорциональна концентрации sIgE в сыворотке крови. Большой популярностью пользуется автоматизированный иммунный анализ, основанный на явлении хемилюминесцентного свечения. Характеристики автоматических иммуноанализаторов отличаются широтой диапазона тестов, производительностью более 100 тестов в час, возможностью выполнения экстренных исследований, хранением калибровочных кривых, что исключает необходимость проводить неоправданно частые калибровки лабораторного оборудования. Несмотря на ряд преимуществ, ИХЛА имеет и ряд недостатков, главный из которых — высокая стоимость 
исследования [3].
    В настоящее время тест-система ImmunoCAP (Швеция) наиболее широко используется в ведущих аллергологических клиниках США, Европы, Японии и фактически является «золотым стандартом» лабораторной аллергодиагностики, с которым сравниваются другие методы [4]. Идея технологии заключается в возможности обнаружения в сверхмалом количестве крови пациента сверхнизких концентраций sIgE (предел количественного определения составляет 0,1 kU/l, хотя до недавнего времени не было возможности точно измерить уровень ниже 0,35 kU/l). Технически это реализуется путем использования специального вспененного материала, производного бромциан-активированной целлюлозы. Благодаря своей пористой структуре материал имеет большую поверхность взаимодействия и обеспечивает высокую константу связывания с нанесенным на него антигеном или антителом. Площадь поверхности такого материала (сорбционная емкость твердой фазы) в 150 раз больше внутренней поверхности обычной лунки или пробирки [5, 6].
    Для детей раннего возраста клинически значимыми являются более низкие уровни sIgE. Так, у детей младше 2 лет уровень sIgE к молоку 5 kU/l и куриному яйцу 2 kU/l уже обладает 95% положительной предиктивной значимостью (positive predictive values, PPV). PPV представляет собой пропорцию положительных результатов в статистике и диагностических тестах, которые являются истинными. Этот показатель рассчитывается с помощью формулы Байеса и характеризует точность измерения. Таким образом, PPV используется в оценке вероятности того, что в случае положительного теста пациент действительно имеет сенсибилизацию к указанному аллергену. Но необходимо учитывать, что значения PPV могут варьировать в разных популяциях, зависеть от возраста пациентов (дети до 2 лет и дети старше 2 лет), стадии заболевания на момент исследования (обострение или ремиссия). Этот показатель, который уже расcчитан для наиболее частых пищевых аллергенов (молоко, рыба, яйцо, пшеница, соя, арахис), представлен в тест-системе ImmunoCAP и помогает клиницисту в подборе диетотерапии у детей раннего возраста и прогнозировании сроков развития толерантности к причинно-значимому продукту, что является бесценным преимуществом методики [7, 8]. Поскольку вероятность появления аллергических симптомов возрастает с увеличением уровня sIgE, интересно наблюдать за состоянием сенсибилизации пациента с самого начала и затем с течением времени. В диапазоне между 0,1–0,69 kU/l уровень сенсибилизации очень низкий, и симптомы возникают редко, но вероятность существует, и этим нельзя пренебрегать. Поэтому мониторинг низкого уровня sIgE-антител с течением времени поможет клиницисту в оценке потенциального риска развития ранних аллергических симптомов.
    Стоит отметить, что данные методы используются для выявления sIgE к единичным аллергенам, хотя для проведения первичной диагностики предпочтительным является использование скрининговых тестов, например такого как определение sIgE к наиболее распространенным аллергенам или комплексное исследование «Фадиатоп» (Phadiatop). Данный тест является элементом лабораторного обследования и позволяет определить повышение уровня sIgE в крови пациента одновременно к аллергенам различных групп, таких как пыльцевые, плесневые, клещевые аллергены, аллергены животных, тараканов и др. Результат исследования будет свидетельствовать о наличии или отсутствии сенсибилизации к указанным ингаляционным аллергенам. Отчет по тесту «Фадиатоп» выглядит как количественный результат (оценка атопии) и считается позитивным при значении >0,35 kU/l. Важность при диагностике аллергопатологии обусловлена чувствительностью теста (>90%). При получении результата свыше 0,70 kU/l 
целесообразно проведение диагностики к единичным аллергенам. Существуют два теста: «Фадиатоп» детский — комплексный скрининговый тест по выявлению sIgE к смеси ингаляционных и пищевых аллергенов для детей до 5 лет и «Фадиатоп» комплексный — скрининговый тест по выявлению sIgE к смеси ингаляционных аллергенов для детей старше 5 лет и взрослых. Данное исследование отличается гораздо большей эффективностью при первичной диагностике аллергопатологии, чем определение общего IgE, т. к. у 50% пациентов с респираторной аллергией выявляется повышенный уровень общего IgE (>100 kU/l). При этом оставшиеся 50% с нормальным уровнем общего IgE не будут идентифицированы. Уровень общего IgE является суммой всех IgE крови и может повышаться также ввиду причин, не связанных с аллергией [9].
    В случае подтверждения атопической природы патологии проводят более детальное обследование для выявления сенсибилизации к виновным аллергенам [1].
    Возможности лабораторной диагностики позволяют исключить необходимость проведения некоторых тестов in vivo, которые создают дискомфорт для пациента, а иногда приводят к жизнеугрожающим состояниям в процессе их проведения [10].
    Потенциал лабораторной диагностики значительно увеличивается за счет развивающихся функциональных тестов — оценки реакции базофильных гранулоцитов при контакте с широким спектром аллергенов in vitro.
    Тест активации базофилов представляет собой провокационный тест, осуществляемый in vitro с использованием специфического аллергена, который активирует базофилы, несущие на поверхности антитела к нему. При наличии у пациента сенсибилизации к тому или иному аллергену наблюдается усиленная активация базофилов, которая сопровождается увеличением экспрессии поверхностных маркеров активации, а также появлением маркеров дегрануляции. Клиническая значимость использования аллергена для оценки активации базофилов признана сопоставимой, но выявленные особенности экспрессии этих маркеров должны учитываться как при заборе крови, хранении и подготовке образцов, так и при оценке позитивного теста. На сегодняшний день представлено несколько коммерческих тест-систем с использованием метода проточной цитометрии (Flow-CAST — Cellular Antigen Stimulation Test; BASOTEST; Allergenicity kit), различаются они по специфическим маркерам для выявления базофилов и оценки их активации. Данный метод дополняет рутинные кожные тесты и определение sIgE в крови, снижает необходимость в провокационных тестах in vivo и рекомендован для диагностики IgE-зависимой аллергии и псевдоаллергических реакций, особенно лекарственной непереносимости, в случаях противоречивых или отрицательных кожных тестов или выявления sIgE. Он используется для оценки эффективности проводимой аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) и лечения анти-IgE-препаратами; определения возможности повторного введения продукта после окончания элиминационной терапии. Особую роль данный тест играет при диагностике аллергии на яд перепончатокрылых насекомых [11].
    При этом постановка точного диагноза и назначение максимально эффективного, персонализированного лечения пациентов с полисенсибилизацией требуют детальной диагностики с использованием широкого спектра аллергенов.
    Полисенсибилизация является важной клинической характеристикой, поскольку она затрагивает около 70–80% населения мира, страдающего аллергией. Диагностический путь требует использования адекватной и тщательной методологии, основанной на соответствии между историей болезни и документированной сенсибилизацией. Распространение данного феномена у пациентов с аллергией следует тщательно оценивать и контролировать. Часто сенсибилизация не соответствует истинной аллергии, и назначение AСИТ (по показаниям) требует особого внимания у пациентов с полисенсибилизацией. Ведение пациентов с полисенсибилизацией должно быть основано на тщательном обследовании с использованием возможностей молекулярной аллергодиагностики [12].

   Молекулярная аллергодиагностика

    Стоит отметить, что в практике врача-аллерголога уже нашла применение компонентная диагностика (Component resolved diagnostic), или молекулярная аллергодиагностика (МА) — подход, используемый для картирования аллергенной сенсибилизации пациента на молекулярном уровне, с применением очищенных натуральных или рекомбинантных аллергенных молекул вместо экстрактов аллергенов. На сегодняшний день более 600 аллергенных молекул для выявления sIgE in vitro доступны для рутинного использования.
     МА позволяет повысить точность диагноза и прогноза при аллергии и играет важную   роль в следующих ключевых аспектах диагностики:
    получение общей информации о сенсибилизирующем профиле;
    дифференцирование доминирующей сенсибилизации к мажорным компонентам и клинически незначимых реакций на минорные компоненты, дающих ложноположительные результаты при проведении кожного тестирования;
    оценка, в отдельных случаях, риска развития острых системных реакций вместо слабых и местных при пищевой аллергии, что уменьшает необоснованное волнение пациента и необходимость проведения пищевых провокационных тестов [13];
    выявление пациентов и причинных аллергенов для прогнозирования целесообразности и эффективности проведения АСИТ (в случае некорректно проведенного лечения есть опасения, что АСИТ с аллергенными компонентами, к которым пациент не чувствителен, может вызвать развитие новой сенсибилизации (неосенсибилизации) и привести к ухудшению симптомов);
    мониторинг изменения сенсибилизации и развития толерантности после проведения АСИТ.
    Для единичных и множественных тестов МА доступны разные платформы. Мультиплексный подход в виде одновременного множественного исследования позволяет охарактеризовать IgE-ответ на широкий спектр заранее отобранных компонентов аллергенов независимо от данных истории болезни.
    Мультиплексный подход в диагностике аллергии основан на использовании аллергенов в фиксированной панели. По этой причине список молекул, включенных в мультиплексные анализы, зависит от релевантности аллергенов, от реальной ценности в процессе диагностики и от способности данной молекулы связываться с твердой фазой.
    При формировании подобных комплексных решений для диагностики используются не только нативные (очищенные) аллергенные молекулы, но и рекомбинантные — полученные методом генной инженерии. Рекомбинантные аллергены воспроизводят основные действующие детерминанты «естественного аллергена», обеспечивают более точную дозировку, их измененная (по сравнению с нативным аллергеном) структура снижает аллергенность и повышает иммуногенность — способность стимулировать выработку блокирующих IgG4-антител. Создание все новых рекомбинантных аллергенов открывает большие перспективы для лабораторной диагностики. В таблице 1 представлена характеристика аллергенов, уже используемых в лабораторной диагностике [4].

    Одним из первых был разработан и описан микрочип (Immuno Solid-Phase Allergen Chip, ISAC) в 2002 г. С тех пор анализ был улучшен, число компонентов увеличилось, и в настоящий момент он является наиболее широко распространенным мультиплексным исследованием в клинической практике. Не так давно были разработаны и описаны другие платформы: MeDALL и Microtest. Характеристики различных доступных платформ приведены в таблице 2 [14].

    Для множественных исследований в рутинной практике на сегодняшний день доступна только одна платформа — ISAC. Это миниатюризованная платформа с очищенными натуральными и рекомбинантными компонентами аллергенов, предназначенная для измерения специфических IgE/IgG-антител в 30 мкл сыворотки или плазмы. Также возможно использование образцов капиллярной крови с целью уменьшения инвазивности теста у маленьких детей. Результаты теста — это моментальная характеристика профиля сенсибилизации пациента, охватывающая специфическую и перекрестно реактивную сенсибилизацию. Ранняя версия микроматрицы содержала 103 компонента аллергенов, последнее поколение микроматриц ISAC содержит 112 специфических и перекрестно реактивных компонентов аллергенов, включая маркеры риска пищевой аллергии, специфические маркеры пыльцы, клещей, животных, плесневых грибов, ракообразных и ядов насекомых, а также маркеры сенсибилизации к перекрестно реактивным карбогидратным детерминантам (ССDs). В состав теста включены аллергокомпоненты из различных белковых групп с разными свойствами и способностью вызывать аллергическую реакцию (табл. 3).

    Реультаты теста определяются полуколичественно в стандартизированных единицах ISAC Standardized Units (ISU) с помощью сканера биочипов и оцениваются с помощью специального программного обеспечения.
    Польза от ISAC продемонстрирована при диагностике большинства аллергических заболеваний. Этот метод предоставляет врачам полную картину профиля сенсибилизации пациента в результате одного теста, а также информацию о специфической и перекрестно реактивной сенсибилизации для упрощения постановки диагноза, оценки риска развития реакций, связанных с определенными аллергенами. Широкий спектр аллергенов на микроматрице помогает выявить неожиданную сенсибилизацию к аллергенам, которые обычно не исследуются, но могут быть причиной симптомов или нести риск развития тяжелых реакций. Эти данные могут помочь с отбором пациентов и подходящих аллергенов для АСИТ в отличие от тестов на основе экстрактов, а также прогнозировать ответ на лечение. В исследовательских работах ISAC предоставляет ценную информацию о марше аллергии и распространении аллергенных молекул на доклинических стадиях аллергических заболеваний, указывая на вероятность развития симптомов аллергии [15, 16].
    В европейских странах в исследовательских целях разработан расширенный тест ISAC–MeDALL (Mechanisms of the Development of Allergy) — чип из 170 очищенных и рекомбинантных специфических и перекрестно реактивных компонентов аллергенов. Тест MeDALL позволяет исследовать не только IgE-реактивность в сыворотке, но и реактивность IgG, IgG4 и IgA. MeDALL был основан на новом, поэтапном, крупномасштабном и интегративном подходе, предложенном экспертами в областях аллергии, эпидемиологии, биохимии аллергенов, иммунологии, молекулярной биологии, эпигенетики, функциональной геномики, биоинформатики, вычислительной и системной биологии, чьи усилия направлены на более углубленное понимание формирования аллергических заболеваний у детей [8].
    В дополнение к популяционному исследованию MeDALL включил экспериментальные исследования на животных и исследования in vitro у детей. Этот метод позволил улучшить понимание генетических и эпигенетических механизмов аллергии. MeDALL был одним из первых проектов, направленных на получение новых знаний о механизмах развития аллергии от раннего детства до взрослой жизни. База знаний MeDALL объединяет данные, собранные у 44 000 участников по 398 клиническим и фенотипическим признакам, и 160 различных наблюдений в 25 разных временных точках c рождения до 20 лет, информацию о 863 генах, участвующих в аллергии [17]. Также в исследованиях было показано, что чип MeDALL подходит для определения аллерген-специфических антител IgG и IgE не только в крови, но и в грудном молоке, что дает возможность изучить передачу аллерген-специфических IgG-антител от матери к ребенку и влияние на развитие аллергической сенсибилизации в будущем [18].
    Исследование MeDALL позволило определить различные атопические фенотипы, ранние маркеры развития IgE-ассоциированных аллергических заболеваний, алгоритмы прогнозирования риска развития аллергических заболеваний у детей, предоставило данные об индивидуальной восприимчивости развития IgE-ассоциированных аллергических заболеваний, новых принципах отбора пациентов для проведения АСИТ, а также персонализации рекомендаций и проводимого лечения. Чип MeDALL разработан только для проведения популяционного исследования, и его использование в рутинной практике недоступно [19, 20].
    Альтернативой ISAC представляется микрочип Allergy explorer (ALEX), который представлен в качестве инновационного набора аллергокомпонентов для исследования расширенного IgE-профиля. ALEX уже доступен для обследования пациентов в странах Европы. Его отличительной особенностью является наиболее широкий спектр (282) аллергокомпонентов, доступных для диагностики при одновременном определении общего IgE в рамках одного теста. Такой диагностический спектр позволит охватить более чем 99% всех диагностических потребностей [21].

  Заключение

   Новые правила предиктивной и персонализированной медицины, которые помогают получить максимальный результат от специфических и высокоперсонализированных методов лечения, в полной мере применимы в аллергологии. Внедрение сложных методик, основанных на использовании аллергокомпонентов, — достойное персонализированной медицины решение для лечения пациентов с аллергией.
    Будущее аллергологии принадлежит компонентной диагностике, позволяющей расшифровать профиль сенсибилизации на молекулярном уровне, прогнозировать ургентные аллергические реакции, оценить тяжесть состояния, обусловленную аутоаллергией, определить объективные показания и противопоказания к назначению АСИТ, а также максимально индивидуализировать лечение и используемые рекомендации [1].