Поиск клинических эквивалентов иммунотропных эффектов антибактериальных средств

Е. Н. Карева*, доктор медицинских наук, профессор
С. К. Яровой**, 1, доктор медицинских наук
Н. С. Александров*
* ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова МЗ РФ, Москва
** ФГБУ НИИ урологии МЗ РФ, Москва

В настоящее время выходит огромное количество публикаций, посвященных влиянию противомикробных средств на иммунную систему. Некоторые из иммунологических эффектов антибактериальных препаратов достаточно ярки и хорошо изучены, как, например, иммуномодулирующие свойства макролидов и нитроимидазолов, другие все еще являются предметом изучения и научной дискуссии.

Основная проблема едва ли не всех исследований, посвященных этому аспекту фармакологии, — сложность применения результатов в реальной клинической практике. В настоящей работе мы сделаем попытку связать иммунологические клинические эффекты наиболее часто применяемых в урологической практике антибактериальных средств.

Основная задача специальности «клиническая фармакология» может быть выражена одним словом: выбор. Выбор лекарственного препарата. Точнее, помощь лечащему врачу в адекватном и обоснованном выборе лекарственного препарата для конкретного больного при конкретной клинической ситуации. Причем обоснование это не должно быть ссылкой на стандарт (рекомендации, распоряжения, иные документы). По мнению авторов, выбор лекарственного препарата должен определяться спектром его антибактериальной активности (если речь идет об антибиотиках), а также особенностями фармакокинетики и фармакодинамики, в том числе и иммунотропными свойствами.

Из этого следует, что практическая рекомендация должна представлять собой схему или обоснование выбора конкретного препарата для конкретной клинической ситуации с учетом возможного влияния предлагаемого лекарственного средства на иммунную систему пациента. Вполне очевидно, что предлагаемая техника выбора препарата с учетом его иммунологических эффектов не должна противоречить ранее разработанным и доказавшим свою клиническую эффективность методикам. Учет иммунологических эффектов может лишь дополнять имеющиеся критерии выбора лекарственных средств, выполняя роль «тонкой настройки».

Для «выхода на практику» с иммунологическими свойствами антибиотиков существует несколько путей. Первый путь «от препарата» — тот, который наиболее часто встречается в научных публикациях. Исследователь находит какие-либо иммунотропные особенности у препарата и согласно им дает рекомендации такого плана: «изучаемый препарат при данной клинической ситуации предпочтительнее, потому что он стимулирует/подавляет/не влияет на выработку провоспалительных/противовоспалительных цитокинов» (в зависимости от того, что в конкретный момент времени целесообразно). Вполне понятно, что в таком режиме почувствовать иммунотропный эффект затруднительно, если вообще возможно, так как он слишком слаб по сравнению с прямым антибактериальным.

Второй путь «от эффекта» значительно сложнее. Суть его в том, чтобы искусственно создать ситуацию, в которой иммунологический эффект из разряда умозрительных, предполагаемых на основе результатов исследований in vitro перешел бы в реальный клинический. Тогда появляется возможность найти клинический эквивалент выявленных иммунологических феноменов. Для этого нужно подобрать препараты, имеющие по результатам исследований in vitro разные иммунологические эффекты, и назначать их при одном и том же диагнозе.

Теперь обсудим, что можно оценивать в клинике. Самый показательный вариант — процент достигнутых ремиссий или излечений. Однако, учитывая достаточно слабую выраженность иммунотропных эффектов антибактериальных препаратов, для получения статистически значимых результатов может потребоваться слишком большая выборка пациентов. При этом варианте построения исследования достаточно велик вклад субъективного влияния лечащих врачей, особенно если препарат назначается в эмпирическом режиме, по сути, посредством «угадывания».

При втором варианте объектом оценки является время достижения ремиссии или излечения. На наш взгляд, данный вариант лучше, так как воздействие на иммунную систему, если препарат назначен верно, может приблизить или отдалить ремиссию, но не предотвратить или индуцировать ее. Такой подход подразумевает жесткие критерии включения, которые должны обеспечить максимальное нивелирование сопутствующих факторов, влияющих на течение болезни. Другим положительным аспектом является низкий процент субъективного участия, так как если обсуждается время достижения ремиссии, значит, в исследование включаются только те пациенты, у которых ремиссия рано или поздно развилась, а назначенный препарат был эффективен. Выведение из исследования группы больных с неэффективной терапией позволяет свести к минимуму влияние на результаты такого параметра, как степень владения врачом методикой эмпирической антибактериальной терапии.

По последней схеме мы и построили наше исследование.

Материалы и методы исследования

Для исследования иммунотропных свойств антибактериальных препаратов in vitro были отобраны 10 пациентов, страдающих хроническим обструктивным пиелонефритом, осложненным хронической почечной недостаточностью (скорость клубочковой фильтрации < 25 мл/мин), получающих лечение в ФГБУ НИИ урологии МЗ РФ в 2011–2012 гг., и 10 призывников, не имеющих соматических заболеваний, поступивших на обследование по поводу энуреза, проходивших обследование в ГКУБ № 47 ДЗМ в 2011–2012 гг.

Выбор лекарственных препаратов для исследования осуществлялся по нескольким позициям:

• широкое применение в реальной урологической практике;
• доказанная эффективность для лечения неспецифических инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы (уровень доказательности А или B);
• доступность (в том числе и экономическая) препарата на отечественном рынке.

Проанализировав имеющуюся информацию, мы пришли к выводу, что в наибольшей мере указанным требованиям отвечают фторхинолон II поколения ципрофлоксацин, цефалоспорин III поколения цефтриаксон, аминогликозид III поколения амикацин, карбапенем меропенем, гликопептид ванкомицин.

Иммунологические исследования проводились на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии ГБОУ ВПО РНИМУ. Выделение мононуклеарной фракции крови проводили по методу Boyum [1]. Все операции проводились в температурном режиме 0–4 °С. Для инкубации клеток мононуклеарной фракции периферической крови с антибактериальными препаратами исследуемые препараты вносили в лунки 96-луночного стерильного плоскодонного планшета (COSTAR) кроме контроля так, чтобы их конечная концентрация в инкубационной среде составила от 3 до 50 мкг/мл в соответствии с С_max препаратов. Суспензию клеток (~1 млн/лунку) помещали в планшет и культивировали в стерильных условиях при 37 °С в условиях 5% СО₂ в течение 72 часов с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). При культивировании клеток использовали стандартную среду RPMI-1640 с добавлением 20% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл (НИИЭиМ им. Н. Ф. Гамалеи). Для стимуляции пролиферации в каждую лунку вносили фитогемагглютинин до конечной концентрации в инкубационной среде 1 мкг/мл. Конечный объем инкубационной среды составил 200 мкл. Количество и жизнеспособность клеток оценивали в камере Горяева в присутствии 0,1% раствора трипанового синего. По окончании инкубации для анализа уровня цитокинов иммуноферментным методом отбирали по 100 мкл инкубационной жидкости из каждой лунки. Все исследования проводились в триплетах. Иммуноферментный анализ проводили согласно инструкции, прилагаемой к наборам реагентов ФНО-α, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-1β («Вектор-БЕСТ», Россия). Регистрацию результатов проводили с помощью планшетного фотометра («Униплан» АИФР-01, Россия), измеряя оптическую плотность при длине волны 450 нм.

Клиническая часть исследования представляла собой ретроспективный анализ фармакотерапии 350 пациентов, страдающих острым обструктивным пиелонефритом на фоне мочекаменной болезни (критерий включения), проходивших лечение ФГБУ НИИ урологии МЗ РФ и ГКУБ № 47 ДЗМ в 2011–2012 гг.

Критериями исключения послужили сопутствующие заболевания, вызывающие иммунодефицит, в том числе злокачественные новообразования, сахарный диабет, ВИЧ-инфекция и т. д.; прием иммуносупрессантов или иммуностимуляторов/иммуномодуляторов; почечная недостаточность, независимо от этиологии и выраженности; тяжелые сопутствующие заболевания, приводящие к изменению фармакокинетических параметров лекарственных средств (например, ишемическая болезнь сердца, осложненная недостаточностью кровообращения III–IV ст., цирроз печени и т. д.); сопутствующие заболевания инфекционной этиологии, требующие приема противомикробных препаратов; гнойно-деструктивные формы пиелонефрита; а также неэффективность стартовой антибактериальной терапии вне зависимости от причины, в том числе и необходимость дополнить схему лечения вторым антибактериальным средством.

Пациенты были разделены на 3 группы согласно назначенному антибактериальному препарату: цефтриаксон (115 пациентов), ципрофлоксацин (120 пациентов), меропенем (115 пациентов).

Объектом изучения было время, прошедшее с момента начала стартовой антибактериальной терапии (эмпирической или согласно антибиотикограмме — не принципиально) до достижения ремиссии. Под достижением ремиссии подразумевалось исчезновение клинических и лабораторных проявлений активности воспалительного процесса в почках — нормализация общего состояния больного, исчезновение отека почки по данным ультразвукового сканирования, лейкоцитоза, палочкоядерного сдвига лейкоцитарной формулы влево и других гематологических индикаторов активности воспалительного процесса, лейкоцитурии.

Статистическая достоверность результатов оценивалась с помощью непараметрических критериев Уилкоксона, Манна–Уитни, Крускала–Уоллиса.

Результаты

Основные продуценты ИЛ-1 макрофаги, Т- и В-клетки. У пациентов с нормальной скоростью клубочковой фильтрации амикацин и ванкомицин стимулируют секрецию ИЛ-1β, в то время как меропенем ингибирует продукцию этого интерлейкина (рис. 1), что отчасти совпадает с литературными данными. При терминальной стадии хронической почечной недостаточности функциональная активность мононуклеарной фракции клеток периферической крови (цитокинопродукция) значительно снижена по сравнению с лицами, имеющими нормальную функцию почек. В этих условиях стимулирующее влияние на продукцию ИЛ-1β отмечено только у амикацина, остальные препараты не вызвали значимых изменений.

Основные продуценты ФНО-α макрофаги, Т- и В-клетки, нейтрофилы. В исследовании активность нейтрофилов не учитывается, поэтому уровень суммарного цитокина плазмы может отличаться от полученных результатов. Продукцию ФНО-α у пациентов с нормальной скоростью клубочковой фильтрации достоверно снижают меропенем, ванкомицин и ципрофлоксацин, что соответствует литературным данным. При хронической почечной недостаточности еще в большей степени, чем ИЛ-1, страдает продукция мононуклеарами ФНО-α. В этих условиях достоверного влияния исследуемых антибактериальных препаратов на продукцию цитокина выявлено не было (рис. 2).

Таким образом, стимулированная продукция провоспалительных цитокинов в мононуклеарах при ХПН снижена.

ИЛ-10 синтезируется и секретируется макрофагами, Т-хелперами 2-го типа и В-клетками. Противовоспалительный эффект ИЛ-10 заключается в блокаде продукции провоспалительных цитокинов Т-хелперами 1-го типа.

У пациентов с нормальной функцией почек ванкомицин достоверно подавляет выработку ИЛ-10 мононуклеарами; в то время как ципрофлоксацин и амикацин стимулируют ее (р = 0,048 и 0,052 соответственно), что отчасти совпадает с литературными данными. При хронической почечной недостаточности продукцию этого интерлейкина стимулируют амикацин, меропенем и ципрофлоксацин (рис. 3).

Основные продуценты ИЛ-4 — тучные клетки и Т-хелперы 2-го типа. ИЛ-4 стимулирует активность тучных клеток, эозинофилов и антителопродукцию В-клетками. Все исследуемые антибактериальные средства в разной степени склонны подавлять продукцию ИЛ-4. При нормальной скорости клубочковой фильтрации амикацин и цефтриаксон в меньшей степени уменьшают выработку этого интерлейкина по сравнению с меропенемом, ванкомицином и ципрофлоксацином. При хронической почечной недостаточности наименьшее влияние на продукцию ИЛ-4 оказывает ципрофлоксацин (рис. 4).

Отношение уровня плазменного ИЛ-10 к уровню ФНО-α является индикатором воспалительного ответа и прогностическим признаком тяжести и исхода инфекционного процесса [2]. При нормальной функции почек антибактериальные препараты не влияют на соотношение продукции ИЛ-10/ФНО-α мононуклеарами периферической крови. При тяжелой почечной недостаточности выявлено достоверное повышение индикатора воспалительного ответа при использовании всех изучаемых препаратов — цефтриаксона, амикацина, меропенема, ванкомицина, ципрофлоксацина (рис. 5).

Обсуждение результатов, полученных in vitro

ИЛ-1β и ФНО-α являются провоспалительными цитокинами. Под их влиянием усиливается активность воспалительного процесса, что проявляется усилением экссудации и мобилизации нейтрофилов в очаг воспаления. Высокие уровни этих цитокинов непосредственно после воздействия повреждающего фактора необходимы для формирования адекватного воспалительного ответа, однако в дальнейшем их продукция должна снижаться. В противном случае воспалительная реакция протекает излишне расторможенно, со склонностью к затяжному течению и аутоиммунному повреждению тканей. В реальной клинической практике необходимость назначения антибактериальных препаратов возникает в большинстве случаев при развернутой клинической картине инфекционно-воспалительного заболевания, то есть на этапе, когда процесс экссудации в самом разгаре, а уровни ИЛ-1β и ФНО-α закономерно высоки. Следовательно, предпочтительнее, чтобы назначаемый лечебный препарат снижал продукцию указанных интерлейкинов. При нормальной функции почек наиболее выраженным подавляющим влиянием на выработки ИЛ-1β и ФНО-α обладает меропенем, что должно существенно дополнять его эффект при лечении тяжелых инфекционно-воспалительных заболеваний с высокой активностью процесса. Изолированный депрессорный эффект в отношении продукции ФНО-α также отмечен у ванкомицина и ципрофлоксацина.

У больных, страдающих почечной недостаточностью, ситуация диаметрально противоположная. Хроническая почечная недостаточность является очень значимым фактором, снижающим уровень провоспалительных цитокинов. В реальной клинической практике крайне редко встречаются пациенты с аутоиммунными заболеваниями, тем более с высокой активностью, возникшими на фоне предсуществующей тяжелой почечной недостаточности. Поэтому для формирования адекватного воспалительного ответа уровни провоспалительных цитокинов могут оказаться недостаточными. Отсюда следует, что подавлять их выработку в этой ситуации нежелательно. Исследуемые препараты не оказали достоверного подавляющего влияния на выработку провоспалительных цитокинов мононуклеарами периферической крови в условиях хронической почечной недостаточности, а у амикацина выявлен статистически подтвержденный стимулирующий эффект на продукцию ИЛ-1β. Практическое значение этого эффекта невелико, так как в связи с нефротоксичностью применение амикацина на фоне дефицита фильтрации крайне нежелательно.

ИЛ-10 обладает противовоспалительной активностью и является антагонистом ИЛ-1β и ФНО-α. В условиях высокоактивного инфекционно-воспалительного процесса, когда назначается антибактериальная терапия, весьма желательна стимуляция выработки этого цитокина. Согласно результатам проведенного исследования, этот эффект в наибольшей степени присущ ципрофлоксацину и амикацину, причем независимо от функции почек. Стимулирующий эффект меропенема выражен слабее, статистически достоверные различия выявлены только при почечной недостаточности. Также отмечено депрессорное влияние ванкомицина на продукцию ИЛ-10, но только при нормальной функции почек. Если обратить внимание на стимулирующее влияние ванкомицина в отношении продукции провоспалительных цитокинов, то складывается впечатление, что иммунологические эффекты ванкомицина в условиях нормальной функции почек неблагоприятны. Они усиливают процесс экссудации, способствут длительному течению воспаления с высокой активностью, создают предпосылки для аутоиммунной агрессии. Однако на фоне хронической почечной недостаточности в условиях интоксикации, иммунодефицита эти эффекты помогают сформировать нормальный воспалительный ответ.

Под влиянием ИЛ-4 происходит сдвиг иммунного ответа в сторону образования антител. На сегодняшний день литературных данных о корреляции между уровнем ИЛ-4 и характеристиками воспалительного процесса мы не нашли. Однако в условиях острого инфекционно-воспалительного заболевания выработка антител к микроорганизму-возбудителю в высоком титре — процесс безусловно желательный. Как уже было отмечено выше, все исследуемые препараты вне зависимости от состояния почечной функции склонны подавлять выработку этого интерлейкина. При нормальной функции почек наименьшее влияние на выработку ИЛ-4 оказывает амикацин и цефтриаксон, при хронической почечной недостаточности — ципрофлоксацин.

Изменения индикатора воспалительного ответа оказались достаточно неожиданными. При нормальной функции почек создается впечатление, что он вообще не зависит от иммунотропных эффектов антибактериальных препаратов. В условиях почечной недостаточности, на наш взгляд, этот показатель практически лишен смысла, так как он подразумевает высокий уровень провоспалительных цитокинов на ранних стадиях воспалительного процесса, который в последующем при благоприятном течении заболевания должен сменяться ростом концентрации противовоспалительных цитокинов. При почечной недостаточности стимулированные эндотоксином уровни провоспалительных цитокинов низки, что делает бессмысленным весь дальнейший расчет.

По полученным in vitro результатам можно сделать следующие заключения об иммунотропных свойствах антибактериальных препаратов:

• при тяжелой почечной недостаточности функциональная активность мононуклеарной фракции клеток периферической крови снижена по сравнению с лицами, имеющими нормальную функцию почек;
• ванкомицин: влияние на выработку цитокинов ванкомицина при нормальной функции почек неблагоприятно (стимуляция провоспалительных и подавление противовоспалительных цитонинов), однако при хронической почечной недостаточности эти же самые эффекты позитивны;
• цефтриаксон: цефтриаксон в наименьшей степени влияет на выработку цитокинов. В принципе, это неплохо, так как эффект от этого становится более предсказуемым;
• ципрофлоксацин: влияние ципрофлоксацина на выработку цитокинов в целом позитивно, не зависимо от состояния почечной функции, хотя и не так ярко выражено по сравнению с ванкомицином, это заключается в подавлении секреции ФНО-α при нормальной функции почек, стимуляции противовоспалительных цитокинов вне зависимости от скорости клубочковой фильтрации, незначительном подавлении ИЛ-4, особенно при почечной недостаточности;
• амикацин: иммунологические эффекты амикацина неоднозначны, он стимулирует выработку как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов, этот эффект сохраняется и в условиях почечной недостаточности; амикацин достаточно слабо подавляет выработку ИЛ-4;
• меропенем: иммунологические эффекты меропенема при нормальной функции почек позитивны, он подавляет выработку провоспалительных цитокинов, не влияя на выработку противовоспалительных, при хронической почечной недостаточности иммунологические эффекты меропенема выражены в существенно меньшей степени и имеют слабо негативную окраску, он обладает стимулирующим влиянием на противовоспалительный ИЛ-10, что при изначально низких провоспалительных цитокинах нежелательно.

При ретроспективном анализе лекарственной терапии острого обструктивного пиелонефрита на фоне мочекаменной болезни было отмечено, что среднее время достижения ремиссии в группе пациентов, получавших терапию ципрофлоксацином, составило 8,5 ± 2,2 суток, в группе больных, получающих цефтриаксон, — 11,0 ± 3,4 суток, в группе пациентов, которым был назначен меропенем, — 10,4 ± 3,9 суток (рис. 6). Статистический анализ показал достоверные различия (p < 0,05) по изучаемому показателю между группой пациентов, получавших терапию ципрофлоксацином, по сравнению с группами больных, которым были назначены бета-лактамные антибиотики. Достоверных различий между группами больных, получавших цефтриаксон и меропенем, не выявлено (p > 0,05).

Обсуждение

Результаты проведенного анализа побуждают к дискуссии. С одной стороны, полученные данные подтверждают результаты исследований in vitro, в том числе и наших собственных, согласно которым иммунологические эффекты ципрофлоксацина в целом позитивны не зависимо от состояния почечной функции. Это заключается в подавлении секреции ФНО-α при нормальной функции почек, стимуляции противовоспалительных цитокинов вне зависимости от скорости клубочковой фильтрации, незначительном подавлении ИЛ-4, более выраженном при почечной недостаточности.

В то время как меропенем имеет менее яркие, по сравнению с ципрофлоксацином, также позитивные иммунологические эффекты, но лишь при нормальной функции почек. Он подавляет выработку провоспалительных цитокинов, не влияя на выработку противовоспалительных, обладает наименьшей в этой ситуации миелотоксичностью. При развитии хронической почечной недостаточности иммунологические эффекты меропенема выражены в существенно меньшей степени и приобретают слабо негативную окраску. Он обладает стимулирующим влиянием на противовоспалительный ИЛ-10, что при изначально низких провоспалительных цитокинах в условиях сниженной почечной функции нежелательно.

Цефтриаксон по сравнению с фторхинолонами, карбапенемами, аминогликозидами и гликопептидами в наименьшей степени влияет на выработку цитокинов. Можно считать его препаратом сравнения.

С другой стороны, возможны и возражения, так как чувствительность микроорганизма к антибактериальному препарату и скорость его эрадикации в присутствии данного препарата величина непостоянная, колеблющаяся не только в рамках семейств и родов микроорганизмов, но даже разные штаммы одного вида возбудителя могут иметь радикальные отличия по этому показателю [3, 4]. Отсюда следует, что назначение среднетерапевтической дозы антибактериального средства в ситуации, когда возбудитель имеет сниженную чувствительность к нему, когда требуются высокие дозировки или особые методики введения (например, длительная инфузия карбапенемов), может приводить к замедленной эрадикации микроорганизмов и медленному развитию положительной динамики безо всякого участия иммунологических эффектов.

Подобные сомнения у нас были еще на этапе планирования исследования, по­этому целесообразно обратить внимание на неслучайность выбора нозологической формы для изучения — острого обструктивного пиелонефрита. При отсутствии адекватной медицинской помощи, в том числе и при ошибочном выборе антимикробных средств, острый обструктивный пиелонефрит склонен быстро переходить из серозной формы в гнойную, что сопровождается резким ухудшением состояния пациента, угрозой разрушения почки и развития бактериотоксического шока [5]. Поэтому все пациенты, страдающие острым обструктивным пиелонефритом, находятся под пристальным вниманием медицинского персонала. Отсутствие явной положительной динамики от назначенного антибактериального препарата в течение 1–1,5 суток при условии адекватного дренирования почки в большинстве случаев расценивается лечащим врачом-урологом как неэффективность проводимой терапии, что влечет за собой назначение препарата резерва. Отсюда следует, что большая часть случаев замедленной эрадикации возбудителя из исследования выпадает.

Заключение

Сейчас вполне очевидно, что для разработки каких-либо практических рекомендаций данных все еще недостаточно. Наряду с исследованиями in vitro, целесообразно изучить изменения имунного статуса пациентов, страдающих острым обструктивным пиелонефритом в разные стадии течения болезни. Исследования иммунологических эффектов антибактериальных препаратов в реальном времени in vivo, вероятно, позволят разрешить возникшие сомнения. Также можно отметить, что изучение цитокинопродукции мононуклеаров периферической крови может оказаться полезным при разработке схем персонализованной терапии пациентов, страдающих инфекционно-воспалительными заболеваниями органов мочеполовой системы, особенно на фоне почечной недостаточности, а также других состояний, изменяющих иммунологическую реактивность организма.

Литература

1. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. 1968. Vol. 21. Suppl. 97. P. 1–9.
2. Opal S. M., DePalo V. A. Anti-inflammatory cytokines // Chest. 2000. 117: 1162–1172.
3. Справочник по антимикробной терапии / Под ред. Козлова Р. С. и Дехнича А. В. Смоленск: МАКМАХ, 2010. 460 с.
4. Piccoli G. B., Consiglio V., Colla L. et al. Antibiotic treatment for acute ‘uncomplicated’ or ‘primary’ pyelonephritis: a systematic, ‘semantic revision’ // Int J Antimicrob Agents. 2006; 28 (Suppl 1): S49–S63. doi: 10.1016.
5. Урология. Национальное руководство. Под ред. Лопаткина Н. А. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2009. 1021 с.

Статья опубликована в журнале Лечащий Врач