Определение уровня кортизола в слюне, собранной в позднее вечернее время, в скрининге эндогенного гиперкортицизма | Тимкина Н.В., Цой У.А., Курицына Н.В., Литвиненко Е.В., Васильева Е.Ю., Гринева Е.Н.

Введение

Эндогенный гиперкортицизм (ЭГ, синдром Иценко — Кушинга) — это заболевание, которое развивается вследствие хронического избытка кортизола [1]. Основными причинами ЭГ являются секретирующая адренокортикотропный гормон (АКТГ) аденома гипофиза, кортизол-продуцирующая аденома надпочечника и нейроэндокринная опухоль с эктопической продукцией АКТГ [1]. Смертность при ЭГ в 4–5 раз выше, чем в общей популяции [2, 3]. Вместе с тем показано, что нормализация уровня кортизола при адекватном лечении ЭГ позволяет улучшить прогноз жизни пациентов [1, 4]. Одним из условий успешного решения этой задачи является ранняя диагностика ЭГ, что может быть обеспечено наличием чувствительных и специфичных диагностических тестов [5]. Согласно международным рекомендациям для скрининга при подозрении на ЭГ следует использовать одно из исследований: определение суточной экскреции свободного кортизола с мочой (СЭСКМ), определение уровня кортизола в слюне (КС), собранной в позднее вечернее время, определение уровня кортизола в сыворотке крови (КСК), взятой утром после приема 1 мг дексаметазона накануне в 23:00 (малая дексаметазоновая проба, МДП), тест с 2 мг дексаметазона. Для подтверждения наличия ЭГ достаточно получить положительные результаты двух из вышеперечисленных тестов [1]. В российских клинических рекомендациях по диагностике и лечению болезни Иценко — Кушинга приоритет отдается двум тестам: определению уровня КС, собранной в 23:00, и МДП [6]. Выбор первых двух тестов в качестве исследований 1-й линии является оправданным, т. к. скрининг при подозрении на ЭГ в большинстве случаев выполняется амбулаторно. Исследование уровня КС, собранной в позднее вечернее время, максимально соответствует требованиям, предъявляемым к скрининговым тестам, и является методом выбора для скрининга ЭГ [1, 6–9]. Тест обладает высокой точностью, он неинвазивный, не требует много времени и является простым в исполнении, может быть легко выполнен пациентом самостоятельно в домашних условиях после получения специального контейнера и инструкции для сбора слюны [1, 6, 8]. Также он лишен ограничений, характерных для исследования СЭСКМ и тестов с дексаметазоном [1, 6]. Однако недостатком этого метода является отсутствие единого стандартизированного метода оценки и, как следствие, отсутствие единых референсных значений для уровня КС, собранной в позднее вечернее время, а также единой точки разделения нормы и ЭГ [10, 11]. В настоящее время в мире используют два основных метода оценки КС: иммунный анализ и метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией [10, 12–14]. С учетом разнообразия методов оценки уровня КС рекомендуется в каждой лаборатории разрабатывать свои референсные и пороговые значения [1, 6, 11].

В течение последних лет для определения уровня КС широкое распространение в Российской Федерации получил метод автоматизированного электрохемилюминесцентного анализа (ЭХЛА). В клинических рекомендациях Российской ассоциации эндокринологов по диагностике и лечению болезни Иценко — Кушинга для метода ЭХЛА рекомендована точка разделения 9,4 нмоль/л как пороговая для диагностики ЭГ [6]. Однако, согласно данным исследования, по результатам которого была предложена эта точка разделения, высокие чувствительность (84,4%) и специ­фичность (92,3%) порогового значения 9,4 нмоль/л были получены для диагностики ЭГ среди пациентов с ожирением [15]. Вместе с тем известно, что не у всех пациентов с синдромом Кушинга имеет место ожирение [16–19]. В связи с этим в ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Мин­здрава России при оценке уровня КС, собранной в позднее вечернее время, методом автоматизированного ЭХЛА для диагностики ЭГ в период с 2015 по 2018 г. использовалось пороговое значение 6,7 нмоль/л, которое предложено в качестве референсного согласно инструкции к набору реагентов для количественного определения КС.

Целью настоящего исследования было проанализировать результаты оценки уровня КС, собранной в позднее вечернее время, выполненной методом ЭХЛА в лаборатории ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, у пациентов с различной массой тела, обследованных в связи с подозрением на ЭГ, и определить оптимальное пороговое значение данного показателя для диагностики синдрома Кушинга у этой категории пациентов.

Материал и методы

Было проведено ретроспективное когортное исследование. Для выявления пациентов, которым с целью скрининга ЭГ выполнялся анализ слюны, собранной в позднее вечернее время, на кортизол, была изучена база данных лаборатории ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России в период с 2015 по 2018 г. Было найдено 420 результатов тестов на КС, собранной в позднее вечернее время у амбулаторных и стационарных пациентов. Затем в системе регистрации медицинских данных Quality Management System были изучены электронные истории болезни с целью выбора пациентов, соответствующих критериям включения.

В исследование включали мужчин и женщин в возрасте от 18 лет и старше, у которых уровень КС, собранной в позднее вечернее время, был определен с целью скрининга на ЭГ. Также у данных пациентов должен был быть известен результат как минимум одного из следующих тестов: СЭСКМ, КСК, забранной в полночь, МДП. Критерии невключения были следующими: беременность, работа в ночную смену, указание на кровоточивость десен, прием глюкокортикоидов и блокаторов стероидогенеза, острые инфекционные заболевания, уровень гликированного гемоглобина более 7,5% при наличии сахарного диабета, тяжелая сопутствующая соматическая патология, терминальные состояния. Всего в исследование было включено 100 пациентов (28 мужчин, 72 женщины), медиана возраста составила 46 лет [34; 61].

Методика исследования уровня
кортизола в слюне

Анализ слюны на кортизол назначали врачи-эндокринологи НМИЦ им. В.А. Алмазова при подозрении на ЭГ согласно критериям международных и российских рекомендаций [1, 16]. Все пациенты заполняли информированное добровольное согласие на обработку персональных данных. Специальный контейнер для сбора слюны Salivette Sarstedi (SARSDEDT AG&CO, Германия) и инструкцию по сбору слюны пациенту выдавал врач-эндокринолог, который рекомендовал обследование. Сбор слюны проводился пациентом самостоятельно с 23:00 до 24:00. За сутки до сбора анализа пациентам было рекомендовано воздерживаться от употребления алкоголя; за 30 мин — от курения, употребления каких-либо напитков, кроме простой воды, от чистки зубов. После сбора слюны контейнер помещали в холодильник (не в морозильное отделение). На следующее утро после сбора слюны контейнер доставляли в лабораторию (пациент самостоятельно из дома или медперсонал, если обследование проводилось в стационаре), не допуская его нагрева. Пробирки центрифугировали в течение 2–3 мин на скорости 1000 оборотов в минуту. Определение уровня КС методом автоматизированного ЭХЛА выполнялось с использованием автоматического анализатора Cobas e411 («Хоффманн-Ля Рош», Швейцария). В лаборатории НМИЦ им. В.А. Алмазова референсным значением для КС, собранной в позднее вечернее время, является 6,7 нмоль/л.

Для диагностики ЭГ использовали следующие критерии: уровень КС, собранной в позднее вечернее время, 6,7 нмоль/л и выше и наличие как минимум одного из перечисленных условий: повышение СЭСКМ; отсутствие снижения уровня кортизола в сыворотке менее 50 нмоль/л при проведении МДП; КСК, забранной в полночь, 207 нмоль/л и выше. В случаях, когда уровень КС был ниже 6,7 нмоль/л, выполнялся как минимум один дополнительный диагностический тест. Если его результаты свидетельствовали против ЭГ, дальнейшее обследование не проводили. Если результаты второго теста были в пользу ЭГ, выполняли еще один или два дополнительных теста, если они были положительными, устанавливали диагноз ЭГ. При уровне КС, собранной в позднее вечернее время, 6,7 нмоль/л и выше пациента обследовали в эндокринологическом отделении НМИЦ им. В.А. Алмазова. Диагноз считали подтвержденным при наличии как минимум двух тестов, свидетельствующих в пользу заболевания [6]. Сбор суточной мочи на кортизол проводился согласно клиническим рекомендациям Российской ассоциации эндокринологов по диагностике и лечению болезни Иценко — Кушинга [6].
Исследование проводилось методом ЭХЛА с использованием анализатора Cobas e411. Референсное значение составляет 38–208 нмоль/л/сут. МДП выполняли согласно рекомендованной методике [6]. Исследование КСК проводили методом ЭХЛА, точкой разделения для диагностики ЭГ считали значение 50 нмоль/л и более. Исследование КСК в полночь выполняли пациентам, которые находились в стационаре как минимум через 48 ч после госпитализации. Забор крови осуществлялся у бодрствующих пациентов в 24:00. Для оценки результата использовали точку разделения менее 207 нмоль/л (7,5 мкг/дл), предложенную D. Papanicolaou et al. [20].

Статистический анализ проведен с помощью пакета IBM SPSS Statistics v. 23 (США). Поскольку распределение показателей не было нормальным, данные представлены в виде медианы и квартилей [25 перцентиль;75 перцентиль]. Достоверность различий оценивалась с помощью критерия χ-квадрата Пирсона с поправкой Йетса, а для непрерывных данных сравнение проводилось с помощью критерия Манна — Уитни. Поиск точки разделения значения КС, собранной в позднее вечернее время, для диагностики ЭГ, с расчетом чувствительности и специфичности проводили на основании построения кривых операционных характеристик (ROC-анализ). В качестве зависимой переменной было выбрано наличие ЭГ. Оптимальной точкой разделения считали показатель КС, которому соответствовала максимальная сумма чувствительности и специфичности метода, рассчитанная по результатам ROC-анализа.

Результаты исследования

Диагноз ЭГ был подтвержден у 28 пациентов, которые составили группу 1 (у 24 пациентов верифицирована АКТГ-продуцирующая аденома гипофиза, у 3 пациентов был выявлен АКТГ-независимый гиперкортицизм вследствие гиперпродукции кортизола образованиями надпочечников, у 1 пациентки — автономная продукция кортизола двусторонними образованиями надпочечников). В 72 случаях данных за гиперпродукцию кортизола не было получено, эти пациенты составили группу 2. Группы 1 и 2 не отличались по полу, возрасту, индексу массы тела (ИМТ). Клиническая характеристика пациентов представлена в таблице 1. В группе 1 уровень КС был 6,7 нмоль/л и выше в 25 случаях. Из 25 пациентов с повышенным уровнем КС в 5 случаях диагноз ЭГ был подтвержден на основании положительных результатов 3 дополнительных тестов (КСК, МДП и СЭСКМ). В 20 случаях основанием для подтверждения ЭГ были положительные результаты 2 тестов: КСК и МДП — у 7 пациентов, КСК и СЭСКМ — у 10 пациентов, СЭКСМ и МДП — у 3 пациентов.

У 3 пациенток уровень КС оказался ниже 6,7 нмоль/л, однако по данным дополнительного обследования во всех 3 случаях был установлен диагноз ЭГ. Из них у 2 пациенток гиперпродукция кортизола была доказана результатами 2 тестов (СЭСКМ и КСК). Впоследствии у них была диагностирована болезнь Иценко — Кушинга, в т. ч. по данным гистологического и иммуногистохимического исследований удаленной аденомы гипофиза. Обе пациентки имели нормальный ИМТ (23 кг/м² и 24 кг/м²). У 1 пациентки с ожирением был установлен диагноз автономной продукции кортизола надпочечниками по результатам 2 дополнительных тестов (нормальный уровень КСК в полночь и отсутствие адекватного подавления кортизола в сыворотке при проведении МДП). Все пациенты были оперированы (кроме пациентки с автономной продукцией кортизола, которой было рекомендовано динамическое наблюдение), первоначальный диагноз был подтвержден результатами гистологического и иммуногистохимического исследования (АКТГ-секретирующая аденома гипофиза в 24 случаях, кортизол-секретирующая аденома надпочечника в 3 случаях).

В группе 2 из 72 пациентов уровень КС оказался ниже 6,7 нмоль/л в 65 случаях. Из них 31 пациенту был выполнен 1 дополнительный тест, результаты которого также свидетельствовали об отсутствии ЭГ (СЭСКМ — в 15 случаях, МДП — в 3 случаях, КСК — в 13 случаях). В 30 случаях было проведено 2 дополнительных теста, которые подтвердили отсутствие ЭГ (КСК и МДП — у 6 пациентов, КСК и СЭСКМ — у 19 пациентов, СЭСКМ и МДП — у 5 пациентов). Четырем пациентам были выполнены 3 теста (КСК, СЭСКМ и МДП), их результаты оказались отрицательными, ЭГ был исключен. Следует отметить, что при анализе результатов МДП в группе 2 75 процентиль значения кортизола составила 56 нмоль/л (табл. 1). Это объясняется тем, что у 8 пациентов значения кортизола крови после пробы с дексаметазоном были выше 50 нмоль/л. Однако у данных пациентов ЭГ был исключен на основании других тестов (КС, СЭКСМ, КСК).

У 7 пациентов (4 женщины) из группы 2 уровень КС оказался 6,7 нмоль/л и выше, что свидетельствовало в пользу ЭГ. Однако при последующем обследовании ЭГ
был исключен по результатам 2 тестов (СЭКСМ и МДП — в 4 случаях, СЭКСМ и КСК — в 2 случаях, МДП и КСК — в 1 случае). Медиана КС у этих 7 пациентов была 10,19 нмоль/л [8,9; 11,265], максимальное значение КС — 13,1 нмоль/л. У 5 человек было ожирение. При анализе медицинской документации не найдено указаний на кровоточивость десен или нарушение методики сбора КС, однако полностью исключить эти факторы не представлялось возможным. У 2 человек (согласно заключению психолога) причиной ложноположительного результата могли быть расстройство адаптации и депрессия.

Как показано в таблице 1, показатели КС были выше в группе 1 (14 нмоль/л против 3,5 нмоль/л, p<0,0001). Мы проанализировали распределение пациентов с различной массой тела в обеих группах. Оказалось, что количество больных с нормальной и избыточной массой тела и с ожирением не отличалось в обеих группах. Независимо от ИМТ уровень КС в группе 1 был выше, чем в группе 2. Отличий между показателями КС у пациентов с различной массой тела в группе 1 не было выявлено. В группе 2 медиана КС также не отличалась у пациентов с различной массой тела. Распределение пациентов по уровню КС в зависимости от массы тела показано на рисунке 1.

В группе 1 у 5 (18%) пациенток уровень КС оказался выше 6,7 нмоль/л и ниже, чем 9,4 нмоль/л. Из них у 3 было ожирение, у 2 других избыточная масса тела или нормальная масса тела. Во всех случаях был подтвержден диагноз болезни Иценко — Кушинга.

По данным ROC-анализа, оптимальной точкой разделения значения КС, собранной в позднее вечернее время, для диагностики ЭГ с чувствительностью 93% [95% ДИ 74; 97] и специфичностью 87% [95% ДИ 83; 91] оказалось значение 6,6 нмоль/л. Площадь под кривой (AUC) составила 0,944, p<0,001 (рис. 2).

Также с использованием ROC-анализа были оценены чувствительность и специфичность других пороговых значений КС, рекомендованных ранее [15]. Для показателей 9,4 нмоль/л и 6,85 нмоль/л чувствительность оказалась 71% и 89% соответственно, а специфичность — 91,7% и 88% соответственно. Для точки разделения 6,7 нмоль/л чувствительность составила 89,3%, а специфичность — 88%. Результаты оценки специфичности и чувствительности, полученные для других пороговых значений КС, представлены в таблице 2.

Таким образом, для скрининга ЭГ среди пациентов с различной массой тела оптимальным пороговым значением КС, собранной в позднее вечернее время, оказалось 6,6 нмоль/л, точность — 88%. Чувствительность, специфичность и точность для показателей 6,7 нмоль/л и 6,85 нмоль/л также оказались близкими и достаточно высокими (см. табл. 2).

Обсуждение

В нашем ретроспективном исследовании были проанализированы результаты оценки определения уровня КС в позднее вечернее время, выполненной методом ЭХЛА в лаборатории ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, у пациентов с различной массой тела, обследованных в связи с подозрением на ЭГ. По данным проведенного ROC-анализа, оказалось, что для диагностики ЭГ оптимальным порогом уровня КС, собранной в позднее вечернее время, является значение 6,6 нмоль/л с чувствительностью 93% и специфичностью 87%. Наши данные совпали с результатами других исследований, в которых была показана высокая информативность данного метода для диагностики синдрома Иценко — Кушинга [18–22]. Так, в исследовании N. Yilmaz et al. был проанализирован 7-летний опыт применения определения уровня КС методом ЭХЛА для диагностики ЭГ. Были получены данные о том, что точка разделения 0,288 мкг/дл обладала чувствительностью 89,6% и специфичностью 81,6% в диагностике синдрома Кушинга [18]. По данным K.D.S. Jarial et al., пороговое значение 10,54 нмоль/л для КС, собранной в позднее вечернее  время, обладало чувствительностью 85,7% и специфичностью 88,2% [22]. Несмотря на сопоставимые показатели специфичности и чувствительности, обращает на себя внимание широкий разброс пороговых значений, предлагаемых различными авторами [18, 19, 21–23]. Это может быть обусловлено различиями в используемых анализаторах, а также в методике исследований [10–12].

В Российской Федерации в большом количестве лабораторий определение уровня КС осуществляется методом ЭХЛА с использованием анализаторов Elecsys 1010, Elecsys 2010, MODULAR ANALYTICS E170, Cobas e 411, Cobas e 60.
В настоящее время открытым остается вопрос об использовании точки разделения КС для пациентов с ожирением и без ожирения. Известно, что ожирение встречается не у 100% пациентов, которых обследуют в связи с подозрением на ЭГ, включая тех, у кого синдром Иценко — Кушинга оказывается подтвержденным [16–19]. Так, по данным R.A. Alwani et al., среди 73 пациентов, обследованных в связи с подозрением на ЭГ (у 53 была подтверждена болезнь Кушинга, у 20 установлен диагноз «псевдосиндром Кушинга»), ожирение имело место в 60% случаев [19]. Из 249 пациентов, обследованных D. Erickson et al., синдром Кушинга был подтвержден у 47 человек, ожирение имели 28 (60%) из них. А из 202 обследованных, у которых ЭГ не был подтвержден, ожирение было у 135 (66,8%) [17]. По нашим данным, из 28 пациентов с ЭГ 65% имели ожирение, а среди 72 пациентов, у которых синдром Иценко — Кушинга не был подтвержден, ожирение было у 47%, что не противоречит данным других авторов [16–19]. Также в нашем исследовании у 5 (18%) пациентов с ЭГ из 28 уровень КС в позднее вечернее время оказался в диапазоне 6,7–9,4 нмоль/л, у 3 из них имело место ожирение. Таким образом, применение в диагностике ЭГ точки разделения, полученной при обследовании пациентов с ожирением, представляется спорным.

В исследовании Ж.Е. Белой и соавт. для выявления ЭГ также была получена точка разделения 6,85 нмоль/л, которая у лиц с нормальным ИМТ показала чувствительность 91,1% и специфичность 96,9%, а у пациентов с ожирением — чувствительность 91,1% и специфичность 84,6% [15]. Для выявления ЭГ среди лиц с нормальной массой тела чувствительность и специфичность точки разделения 9,4 нмоль/л составили 84,4% и 97,9% соответственно [15]. В нашем исследовании точка разделения 6,85 нмоль/л и точка разделения 6,7 нмоль/л показали очень близкие со значением 6,6 нмоль/л чувствительность и специфичность (89% и 88% соответственно для обоих значений, в сравнении с 93% и 87% соответственно для точки разделения 6,6 нмоль/л). Для этих значений соотношение чувствительности и специфичности оказалось оптимальным в отличие от показателя 9,4 нмоль/л. По данным Ж.Е. Белой и соавт., чувствительность для точки разделения 9,4 нмоль/л оказалась довольно низкой по сравнению с другими пороговыми значениями (а именно 84,4%) как для лиц с ожирением, так и для лиц с нормальным ИМТ [15]. С учетом того, что определение уровня КС, собранной в позднее вечернее время, является скрининговым методом в диагностике ЭГ, высокая чувствительность метода очень важна, т. к. в этом случае количество пациентов, у которых не выявлено заболевание при его наличии, оказывается минимальным. Что касается специфичности, то обязательное дополнительное обследование, предложенное различными клиническими рекомендациями [1, 6], позволяет выявить пациентов с ложноположительным результатом КС, собранной в позднее вечернее время, и исключить диагноз ЭГ.

В нашем исследовании при использовании точки разделения 6,6 нмоль/л было получено 3 ложноотрицательных результата. В 2 случаях ЭГ был верифицирован при помощи исследования уровня кортизола в суточной моче, МДП и исследования КСК в полночь. В обоих случаях это были пациентки с болезнью Иценко — Кушинга с нормальным ИМТ. В 1 случае при обследовании была верифицирована автономная продукция кортизола надпочечниками, что подтверждает данные других исследователей, свидетельствующие о том, что определение уровня КС в позднее вечернее время обладает низкой специфичностью для диагностики автономной продукции кортизола [24]. Так, в работе I. Kuzu et al. было показано, что специфичность этого метода для диагностики субклинического синдрома Кушинга (в настоящее время это состояние называют автономной продукцией кортизола) составляет 60% [24].

Также в нашей работе у 7 пациентов при оценке уровня КС в позднее вечернее время были получены ложноположительные результаты. Причины ложного повышения уровня КС известны и описаны ранее [7–9]. К сожалению, не всегда удается исключить все из них, особенно это касается возможной контаминации микроскопическим количеством крови, что может не определяться визуально, но приводить к ложному повышению показателя КС. Наличие в нашем исследовании ложноотрицательных и ложноположительных результатов анализа уровня КС, собранной в позднее вечернее время, в диагностике ЭГ подтверждает необходимость применения при верификации синдрома Иценко — Кушинга как минимум двух тестов [1, 6].

Заключение

Результаты нашей работы показали, что при обследовании пациентов с подозрением на ЭГ для оценки уровня КС, собранной в позднее вечернее время, более оптимальным является использование точки разделения, определенной для лиц с различной массой тела, включая нормальную массу тела, избыточную массу тела и ожирение. По нашим данным, такой точкой является 6,6 нмоль/л, вместе с тем пороговые значения 6,7 нмоль/л и 6,85 нмоль/л мало уступают в чувствительности и специфичности и также могут быть использованы в диагностике ЭГ.