Модуляция микробиоты кишечника как ведущий фактор патогенеза формирования фенотипов синдрома раздраженного кишечника | Гаус О.В., Ливзан М.А.

Введение

Синдром раздраженного кишечника (СРК) встречается у 10–15% населения во всем мире, значимо влияет на качество жизни пациентов и влечет за собой значительные социально-экономические затраты для общества в целом [1]. Патофизиология СРК включает изменение процессов нейротрансмиссии и взаимодействия по оси «мозг — кишечник», дисфункцию иммунной системы с развитием воспаления низкой степени активности, повышение эпителиальной проницаемости, что в конечном итоге ведет к формированию висцеральной гиперчувствительности и нарушению моторной активности толстой кишки [2]. Многочисленные данные последних лет указывают на то, что модуляция кишечной микробиоты является одним из ключевых факторов патогенеза СРК [3–5]. В частности, имеются данные о шестикратном увеличении риска развития СРК после эпизода острой кишечной инфекции, об эффективности средств, влияющих на кишечную микробиоту (пре-, пробиотики, фекальная трансплантация), в лечении заболевания [6–8]. Кроме того, некоторые эксперты предполагают, что определенные изменения микробиоты кишечника могут быть предиктором развития заболевания и определять характер его течения, а также ответ на лечебные воздействия [9, 10].

На сегодняшний день известно, что кишечник человека населен огромным количеством микроорганизмов, совокупный геном которых по числу генов в 13 раз превышает таковой организма-хозяина [11]. Исследования в области молекулярной генетики показали, что в пищеварительном тракте человека обитает более 2000 видов бактерий, причем большинство из них относятся к четырем основным типам: Bacteroidota, Firmicutes, Actinobacteriota и Proteobacteria [12]. Кишечная микробиота — очень динамичная структура, претерпевающая изменения в течение всей жизни человека, ее первоначальный состав в значительной степени определяется способом родоразрешения (кесарево сечение или естественные роды) и методом вскармливания (грудное или искусственное) [13]. В дальнейшем микробное сообщество продолжает видоизменяться под воздействием факторов окружающей среды, включая регион проживания, прием лекарственных препаратов, стресс, диету и образ жизни [14–16].

Считается, что здоровый состав микробиоты кишечника является основной предпосылкой для правильного функционирования организма человека, а нарушение мутуалистических отношений между представителями микробиоты и хозяином ведет к развитию различных заболеваний и патологических состояний [17, 18]. Во многих работах продемонстрированы значительные сдвиги в микробном пейзаже у пациентов с СРК, однако результаты этих исследований довольно разнородны и противоречивы [19–21].

Цель исследования: оценить состав кишечной микробиоты у больных с СРК во взаимосвязи с особенностями клинического течения заболевания, пищевыми привычками, уровнем тревоги и депрессии, а также в зависимости от выделенных фенотипов.

Материал и методы

Под динамическим наблюдением в нашем центре находились 263 пациента (189 женщин, 74 мужчины) с диагнозом СРК, установленным в соответствии с клиническими рекомендациями Российской гастроэнтерологической ассоциации и Ассоциации колопроктологов России [22]. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России (протокол № 2 от 01.12.2021). Средний возраст больных составил 29 [25; 35] лет. Форма СРК с преобладанием диареи (СРК-Д) диагностирована у 84 (31,9%) человек, СРК с преобладанием запора (СРК-З) — у 92 (34,8%), СРК со смешанным вариантом нарушения моторики (СРК-См) — у 71 (26,9%), неклассифицируемый вариант СРК (СРК-Н) — у 16 (6,4%). Легкое течение заболевания отмечалось у 110 (41,9%) пациентов, среднетяжелое — у 99 (37,6%), тяжелое — у 54 (20,5%).

Настоящее исследование является продолжением ранее опубликованной работы, где, согласно авторской концепции, на основе изучения совокупного влияния факторов генетики и эпигенетики предложено выделение фенотипов СРК [23]. Для определения характеристик каждого фенотипа из всей когорты пациентов были выделены подгруппы: подгруппа 1 — «постинфекционный СРК» (n=45) установлен при наличии связи появления первых симптомов заболевания с эпизодом острой кишечной инфекции, подгруппа 2 — фенотип «СРК у лиц с избыточной массой тела и ожирением» (n=49) — при наличии индекса массы тела 25 и более кг/м2; подгруппа 3 — «коморбидный СРК» (n=75) — при наличии перекреста СРК с другими функциональными расстройствами пищеварительного тракта; подгруппа 4 — «эссенциальный СРК» (n=51) — при отсутствии характерных признаков других фенотипов. В группу контроля вошли 40 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с пациентами с СРК.

Для достижения поставленной цели настоящего исследования методом рандомизации (методом конвертов) среди пациентов с различными фенотипами отобрано 40 образцов кишечной микробиоты (по 10 образцов каждого) и 10 образцов кишечной микробиоты здоровых лиц (группа контроля). Секвенирование биобанка образцов микробиоты кишечника участников нашего исследования проводилось на базе ООО «Кномикс» (г. Москва).

Кроме того, у 220 пациентов с различными фенотипами СРК и 40 человек группы контроля проводилась оценка распространенности и выраженности гастроинтестинальных симптомов по опроснику GSRS и цифровой версии визуально-аналоговой шкалы; структура рациона, пищевые предпочтения и доступность различных продуктов оценивались согласно опросникам WHO CINDI program questionnaire [24] и «Информация о питании и пищевом поведении» [25]; выраженность тревоги и депрессии — по госпитальной шкале тревоги и депрессии HADS [26]; уровень специфической тревоги в отношении гастроинтестинальных симптомов — по индексу висцеральной гиперчувствительности VSI [27].

Дополнительно у всех пациентов с СРК и лиц группы контроля на базе ЦНИЛ ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России проводилось определение уровня гормона стресса кортизола в утренней и вечерней порциях слюны (диагностический набор фирмы Diagnostics Biochem Canada Inc., Канада), нейротрансмиттеров серотонина в сыворотке крови и дофамина в плазме крови (диагностические наборы фирмы IBL, Германия), маркера эпителиальной проницаемости зонулина в кале (диагностический набор фирмы Immundiagnostik, Германия) методом иммуноферментного анализа.

Статистический анализ полученных данных проведен с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel и Statistica v.10.0 (русифицированная версия). В связи с наличием распределения, отличного от нормального, для всех количественных признаков проводили подсчет медианы (Ме), 25-го (Р25) и 75-го (Р75) процентилей. Для сравнения независимых групп использовали критерий Манна — Уитни (U) и критерий Краскелла — Уоллиса (Н). Для анализа качественных данных и анализа частот использовали критерий сопряженности χ2 Пирсона. Степень взаимосвязи между двумя переменными устанавливали методом корреляционного анализа Спирмена с оценкой коэффициента ранговой корреляции (rs). Результаты считали статистически значимыми при p<0,05.

Анализ данных биобанка кишечной микробиоты проведен с помощью платформы «Кномикс-Биота» (https://biota.knomics.ru/). Таксономия определялась с помощью наивного байесовского классификатора QIIME2, обученного на базе SILVA v138 (https://www.arb-silva.de/documentation/release-138/). Метаболический потенциал микробного сообщества оценивали с использованием программы PICRUSt, представленность метаболических путей и модулей — по базам KEGG и MetaCyc.

Для изучения различий в общей композиционной структуре и метаболическом потенциале образцов кишечной микробиоты использовали многомерный дисперсионный анализ (PERMANOVA), метрику альфа-разнообразия оценивали с помощью индекса Шеннона. Множественную корректировку тестирования выполняли с использованием процедуры Бенджамини — Хохберга.

Результаты и обсуждение

Сравнительная характеристика клинических параметров, пищевые предпочтения, выраженность тревоги и депрессии, специфической гастроинтестинальной тревоги, исследуемых лабораторных показателей среди пациентов с СРК в зависимости от выделенных фенотипов и у здоровых лиц представлена в таблице.

Поскольку выборка образцов кишечной микробиоты проводилась рандомно, для последующего анализа ассоциативных взаимодействий изменений состава микробиоты с изучаемыми факторами (диета, выраженность тревоги и депрессии, секреция гормона стресса кортизола, нейромедиаторов серотонина и дофамина, уровень маркера повышенной эпителиальной проницаемости зонулина в кале) использовались данные описанной когорты.

В группе пациентов с СРК микробиота кишечника при изучении методом 16s-секвенирования бактериальной РНК оказалась представлена большим количеством видов бактерий (рис. 1). Статистически значимые различия выявлены по показателю альфа-разнообразия (р=0,039).

О повышении альфа-разнообразия кишечной микробиоты при СРК по сравнению с лицами группы контроля ранее уже сообщалось в исследованиях [28–30], но также были противоположные данные, где показано снижение показателя [31–33] или отсутствие различий [19, 34, 35].

Несмотря на то, что статистически значимых различий состава кишечной микробиоты пациентов с СРК и здоровых лиц обнаружено не было, идентифицированы отдельные микробные таксоны, относительное обилие которых значительно различается между двумя группами. Так, среди пациентов с СРК повышено количество бактерий Firmicutes, Actinobacteriota и Proteobacteria при снижении количества Bacteroidota, Desulfobacterota.

Относительная представленность бактерий на уровне типа в образцах кишечной микробиоты пациентов с СРК (n=40) и здоровых лиц (n=10) представлена на рисунках 1, 2.

Вместе с тем статистически значимые различия были получены при подсчете показателей соотношения Firmicutes : Bacteroidota, который среди пациентов с СРК составил 2,35, тогда как в группе здоровых лиц — 1,33 (р=0,041). Об увеличении соотношения Firmicutes : Bacteroidota сообщалось во многих проведенных ранее исследованиях [28, 29, 36, 37].

В образцах кишечной микробиоты пациентов с СРК по сравнению с образцами группы контроля обнаружены различия на уровне семейств в виде увеличения представленности Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Veillonellaceae на фоне снижения количества Bifidobacteriaceae, Bacteroidaceae, Prevotellaceae, а также родов — относительное снижение количества Bacteroides, Faecalibacterium, Bifidobacterium при повышении числа устойчивых к желчи бактерий Alistipes и Blautia.

Примечательно, что в проведенном нами исследовании статистически значимые различия как по составу, так и по метаболическому потенциалу кишечной микробиоты у здоровых лиц и пациентов с СРК были получены после разделения последних на группы в зависимости от подтипа, степени тяжести и предложенных фенотипов заболевания.

Так, в кишечной микробиоте пациентов с СРК-Д снижена представленность бутиратпродуцирующих бактерий семейств Ruminococcaceae (р=0,038) и Erysipelatoclostridiaceae (р=0,008), относящихся к типу Firmicutes, а также бактерий рода Methanobrevibacter типа Euryarchaeota (р=0,004). При этом отмечено повышение содержания бактерий семейства Enterobacteriaceae рода Escherichia / Shigella типа Proteobacteria (р=0,019). Метаболическая активность кишечной микробиоты в отношении синтеза масляной кислоты путем метаболизма глутарата оказалась значимо ниже по сравнению с лицами группы контроля и пациентами с СРК с другими типами нарушения кишечной моторики (р=0,004).

В группе пациентов с СРК-З в большем количестве встречались бактерии рода Methanobrevibacter (р=0,006) и рода Alistipes типа Bacteroidota (р=0,029), в меньшем количестве были представлены бактерии рода Sutterella типа Proteobacteria (р=0,033).

В группе пациентов с СРК-См в меньшем количестве обнаруживались бактерии семейства Ruminococcaceae типа Firmicutes (р=0,008) и порядка Clostridiales типа Firmicutes (р=0,024).

В группе пациентов с СРК c тяжелым течением заболевания кишечная микробиота оказалась представлена большим количеством видов, характеризовалась низкой метаболической активностью и неспособностью адаптироваться к воздействию факторов окружающей среды. Кроме того, в образцах кишечной микробиоты пациентов с тяжелым течением заболевания в большем количестве по сравнению со здоровыми лицами и пациентами с легким течением заболевания встречались бактерии родов Ruminococcus torques group (р=0,011) и Blautia (р=0,021), в меньшем количестве — бутиратпродуцирующие бактерии семейства Ruminococcaceae (р=0,042) и вида Bacteroides stercoris типа Bacteroidota (р=0,026). Вместе с тем кишечная микробиота пациентов с тяжелым течением СРК также характеризовалась низким синтезом бутирата (р=0,003).

Полученные нами данные согласуются с имеющимися в литературе. Так, в работе M. Pozuelo et al. [38] у пациентов с СРК-Д обнаружено снижение количества бактерий семейств Ruminococcaceae, Clostridiales, Erysipelotrichaceae, Methanobacteriaceae; о снижении числа Methanobacteriaceae в кишечной микробиоте пациентов с СРК-Д сообщали C. Carco et al. [39] и T. Ringel-Kulka et al. [40]. В систематическом обзоре 24 клинических исследований показано, что уменьшение числа строгих анаэробов, воспаление низкой степени активности и усиление кишечной моторики при СРК-Д приводит к размножению неприхотливых бактерий семейства Enterobacteriaceae [41].

В недавнем исследовании обнаружено, что у субъектов с СРК-З более высокая выработка метана в выдыхаемом воздухе прямо пропорциональна более высокому относительному содержанию метаногенов в составе кишечной микробиоты, прежде всего за счет бактерий рода Methanobrevibacter [42]. Хорошо известно, что метан замедляет перистальтику толстой кишки и, как следствие, способствует развитию запоров [18].

Снижение численности Sutterella wadsworthensis наряду с Oxalobacter formigenes и Bacteroides pectinophilus у пациентов с СРК показано в работе I. Masoodi et al. [43]. В нескольких работах обнаружено снижение количества бактерий рода Alistipes у пациентов с СРК-Д и СРК-См [31, 44, 45], в другой — значительное увеличение у детей с СРК-З [46].

Данные, касающиеся связи изменения состава кишечной микробиоты при различных степенях тяжести СРК, немногочисленны. Ассоциация между тяжестью кишечных симптомов СРК и повышенным количеством Ruminococcus torques отмечена в работах E. Malinen et al. [47] и J. Yang et al. [48]. Показано, что бактерии рода Ruminococcus torques group могут индуцировать секрецию провоспалительного белка флагеллина, который способен запускать гуморальный ответ через толл-подобные рецепторы распознавания образов [49]. Кроме того, Ruminococcus torques может расщеплять муцин слизистой оболочки кишечника, нарушая целостность эпителиального барьера [50].

Известно, что комменсальные бактерии Bacteroides stercoris, снижение представительности которых обнаружено нами у пациентов с тяжелым течением СРК, обладают иммуномодулирующими свойствами, синтезируя конъюгированную линолевую кислоту [51–53].

При анализе ассоциаций между таксономическими изменениями кишечной микробиоты и клиническими проявлениями СРК в нашем исследовании выявлены: прямая корреляционная связь между увеличением количества бактерий рода Methanobrevibacter и выраженностью запора (rs=0,583, р=0,003), обратная корреляционная связь между снижением численности бутиратпродуцирующих бактерий семейств Ruminococcaceae и Erysipelatoclostridiaceae и выраженностью абдоминальной боли (rs=-0,429, р=0,026; rs=-0,391, р=0,041 соответственно), а также прямая корреляционная связь между увеличением количества бактерий рода Ruminococcus torques group и такими симптомами СРК, как абдоминальная боль и диарея (rs=0,515, p<0,001; rs=0,488, p=0,017 соответственно). Закономерно, что снижение метаболической активности кишечной микробиоты по пути синтеза бутирата также коррелировало с интенсивностью абдоминальной боли (rs=-0,607, р=0,001).

В опубликованных ранее работах описаны положительная связь кишечных симптомов СРК с количеством Gammaproteobacteria и отрицательные связи с количеством Bifidobacterium spp. (для абдоминальной боли), Faecalibacterium spp., Eubacterium rectale и бутиратпродуцирующих Ruminococcus (для абдоминальной боли, метеоризма) [44]. Кроме того, в исследовании G. Kim et al. [54] увеличение числа Methanobrevibacter у пациентов с СРК-З было связано с более высокими баллами при оценке выраженности запора. В работе J. Yang et al. [48] количество бактерий Ruminococcus torques group коррелировало с количеством энтерохромаффинных клеток в биоптатах слизистой оболочки толстой кишки, степенью тяжести СРК, выраженностью и частотой абдоминальной боли, а также частотой дефекации.

Известно, что состав кишечной микробиоты во многом зависит от диеты человека. В нашем исследовании для пациентов с СРК, у которых отмечалось повышение соотношения Firmicutes : Bacteroidota, характерными пищевыми предпочтениями оказались тяга к сладкой (χ2=18,23, p=0,004) и мучной (χ2=15,47, p=0,029) пище, кондитерским изделиям (χ2=20,56, p=0,002). Кроме того, эти пациенты статистически значимо больше потребляли добавленного сахара (χ2=33,52, p<0,001). В литературе описано, что диета с высоким содержанием сахара, так же как и диета с высоким содержанием жиров, приводит к снижению количества бактерий типа Bacteroidota и увеличению — бактерий типа Firmicutes [55]. Подобные изменения в составе кишечной микробиоты связывают с развитием избыточной массы тела и ожирения, поскольку относительное повышение сахаролитических бактерий типа Firmicutes связано с увеличением производства короткоцепочечных жирных кислот и повышенным усвоением энергии, вырабатывающейся в результате ферментации углеводсодержащих компонентов пищи [56].

Тяга к жирной пище ассоциировалась с повышением количества бактерий рода Alistipes (χ2=11,45, p=0,025), что обнаружено и в ряде других работ, демонстрирующих увеличение количества толерантных к желчи Alistipes, Bilophila, Ruminococcus gnavus, обладающих провоспалительным потенциалом, у лиц, придерживающихся диеты с высоким содержанием насыщенных жиров [14, 57–59].

У пациентов с СРК и низким потреблением свежих овощей и фруктов в составе кишечной микробиоты выявлялось снижение представительности бутиратпродуцирующих бактерий семейств Ruminococcaceae и Erysipelatoclostridiaceae (χ2=26,03, p<0,001; χ2=20,74, p=0,002 соответственно), бактерий рода Bifidobacterium (χ2=29,55, p<0,001), а также отмечалась низкая метаболическая активность кишечной микробиоты по пути синтеза бутирата (χ2=35,59, p<0,001). Хорошо известно, что пищевые волокна метаболизируются бактериями толстой кишки с образованием короткоцепочечных жирных кислот, прежде всего масляной [55].

Закономерно, что уменьшение численности бактерий семейств Ruminococcaceae и Erysipelatoclostridiaceae, а также низкая доступность бутирата среди пациентов с СРК в нашем исследовании были взаимосвязаны с уровнем фекального зонулина, являющегося косвенным маркером повышенной эпителиальной проницаемости (rs=-0,404, р=0,021; rs=-0,399, р=0,034; rs=-0,516, р=0,006 соответственно). Повышенный уровень зонулина также ассоциировался с увеличением численности Ruminococcus torques group (rs=0,485, р=0,019).

В последние годы появляется все больше данных о том, что модуляция кишечной микробиты может изменять биосинтез, высвобождение и обратный захват нейротрансмиттеров [60–62], участвующих в реализации патогенетических механизмов при СРК. В нашем исследовании повышенное содержание бактерий родов Escherichia / Shigella и Ruminococcus torques group коррелировало с высоким уровнем серотонина в сыворотке крови (rs=0,478, р=0,008; rs=0,612, p<0,001 соответственно).

Кроме того, в проведенном нами исследовании обнаружены ассоциации между сокращением численности бактерий рода Bifidobacterium и высокими баллами выраженности депрессии по шкале HADS и показателем индекса VSI (rs=-0,364, р=0,038; rs=-0,401, р=0,022 соответственно). Ранее показано, что депрессивное поведение можно облегчить с помощью пробиотиков, содержащих штаммы Bifidobacterium, за счет влияния на синтез дофамина и серотонина [63, 64].

При анализе состава кишечной микробиоты в зависимости от предложенных фенотипов установлено, что у пациентов подгруппы 1 повышено содержание бактерий родов Bacteroides (р=0,047) и Escherichia / Shigella семейства Enterobacteriaceae (р=0,021), однако снижена представленность бутиратпродуцирующих бактерий семейств Erysipelatoclostridiaceae (р=0,003) и Ruminococcaceae (р=0,038). При этом повышенное содержание бактерий родов Escherichia / Shigella коррелировало с высоким уровнем серотонина в сыворотке крови и зонулина в кале (rs=0,502, р=0,005; rs=0,627, p<0,001 соответственно).

У пациентов подгруппы 2 выявлено снижение количества бактерий родов Bifidobacterium (р=0,019) и Bacteroides (р=0,034) и повышение — бактерий родов Alistipes (р=0,004) и Methanobrevibacter (р=0,001). При этом снижение числа бактерий рода Bifidobacterium коррелировало с выраженностью абдоминальной боли (rs=-0,443, р=0,007), с баллами выраженности депрессии по шкале HADS (rs=-0,579, р=0,002) и низким уровнем дофамина (rs=0,633, p<0,001), а увеличение численности бактерий рода Alistipes — с повышенным уровнем зонулина в кале (rs=0,436, р=0,004).

У пациентов подгруппы 3 повышено содержание количества бактерий рода Ruminococcus torques group (р=0,021) на фоне значимого снижения числа бутиратпродуцирующих бактерий родов Lactobacillus (р=0,038), Erysipelatoclostridium (р=0,006) и семейства Ruminococcaceae (р=0,016). Кроме того, в составе кишечной микробиоты пациентов подгруппы 3 отмечено снижение количества бактерий рода Methanobrevibacter (р=0,010). При этом кишечная микробиота пациентов данной подгруппы характеризовалась низким синтезом бутирата (р=0,002). Повышение численности бактерий рода Ruminococcus torques group в подгруппе 3 коррелировало с выраженностью абдоминальной боли (rs=0,413, р=0,005), диареи (rs=0,369, р=0,025), тяжестью заболевания (rs=0,572, р=0,001), уровнем серотонина в сыворотке крови (rs=0,461, р=0,004) и зонулина в кале (rs=0,519, р=0,003). Вместе с тем снижение представленности бактерий рода Lactobacillus коррелировало с высокими баллами тревоги по шкале HADS (rs=-0,384, р=0,031), повышенным содержанием кортизола в утренней порции слюны (rs=-0,401, р=0,018), а также ассоциировалось с тягой к соленой пище (χ2=13,68, p=0,021).

Микробиота пациентов подгруппы 4 оказалась сопоставимой с таковой у лиц группы контроля, отмечена лишь тенденция к снижению численности бактерий рода Bifidobacterium.

Заключение

Кишечная микробиота пациентов с СРК по сравнению со здоровыми лицами представлена большим количеством видов бактерий, характеризуется низкой метаболической активностью и неспособностью адаптироваться к воздействию факторов окружающей среды, находится в тесной взаимосвязи с особенностями питания, уровнем тревоги и депрессии, а также отличается от микробиоты здоровых лиц по таксономическому составу в зависимости от варианта клинического течения и фенотипа заболевания.

Таким образом, полученные в нашем исследовании данные подтверждают факт того, что изменение состава кишечной микробиоты является важным звеном патогенеза СРК и что модуляция кишечной микробиоты посредством коррекции модифицируемых факторов риска (прежде всего диеты, высокого уровня тревоги и депрессии) и в зависимости от фенотипа заболевания может стать мишенью «таргетной» терапии пробиотическими штаммами. Список литературы Вы можете найти на сайте http://www.rmj.ru