Анаэробные инфекции, вызванные культурами рода Desulfovibrio (обзор литературы) | Куликова Н.Г., Плоскирева А.А.

Введение

Бактерии рода Desulfovibrio относятся к сульфатредуцирующим бактериям (СРБ) и представляют собой изогнутые палочки с полярными жгутиками, не образующие спор [1–3].

Бактерии этого рода являются строгими анаэробами, которые для дыхания восстанавливают сульфат и серу до сероводорода (H₂S) посредством сульфитредуктазы [3]. Они характеризуются наличием пигмента десульфовиридина, который флуоресцирует в длинноволновом ультрафиолетовом (УФ) излучении красным при щелочном рН и сине-зеленым при кислом рН. Для бактерий рода Desulfovibrio характерно также наличие сильного запаха серы при выращивании на жидких питательных средах. Эти микроорганизмы растут медленно: им требуется от 4 до 7 дней, чтобы образовать видимые колонии в питательных средах [2].

Распространенность Desulfovibrio spp.

В окружающей среде СРБ распространены повсеместно [3]. Основными экологическими нишами СРБ считаются почва, морские донные осадки, соленые озера, сточные воды, трубопроводы, в том числе газовые магистрали [4]. СРБ также могут колонизировать желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) млекопитающих — крупного рогатого скота и человека [3–6]. Они могут бессимптомно персистировать в кишечнике или вести себя как условно-патогенные микроорганизмы, связанные с первичной бактериемией и интраабдоминальными инфекциями [2].

Desulfovibrio spp. является преобладающим представителем СРБ в микробиоте кишечника человека. Исследования показали, что выделение штаммов Desulfovibrio spp. из образцов кала человека очень важно для изучения роли кишечных СРБ в этиологии сульфатредуцирующей инфекции, а также в определении их биологических особенностей [7].

При ферментации в толстой кишке человека терминальные окислительные процессы могут включать деятельность диссимиляционных СРБ. Приблизительно у 50% здоровых людей в образцах кала обнаруживаются значительные популяции СРБ. В исследованиях in vitro рост СРБ в смешанной культуре моделировался доступностью сульфата, при этом сульфатированные полисахариды, такие как муцин, хондроитина сульфат и каррагинан, вызывали повышенную скорость роста и продукцию сульфидов по сравнению с крахмалом, пектином и арабиногалактаном [6, 8].

Исследования по выявлению наличия бактерий рода Desulfovibrio в образцах биопсии толстой кишки, основанные на ПЦР, в сочетании с методами микробиологического культивирования показали повсеместное присутствие бактерий рода Desulfovibrio в слизистой оболочке толстой кишки человека [9]. Согласно данным библиотеки клонов 16S рРНК Desulfovibrio является доминирующим родом СРБ, обнаруживаемым в образцах кала человека [10]. Способствовать колонизации кишечника СРБ может сульфат, полученный в результате деградации сульфомуцина, содержащегося в эпителиальных клетках кишечника [10]. На основании результатов популяционных исследований «случай — контроль» канадскими учеными был сделан вывод о том, что инфекция гриппа, особенно с тяжелым течением болезни, способствует чрезмерному росту СРБ в толстой и двенадцатиперстной кишке [11].

Присутствие бактерий рода Desulfovibrio в кишечнике связывают с хроническими воспалительными заболеваниями ЖКТ (язвенный колит, болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника), а также с различными психическими и когнитивными расстройствами (болезнь Паркинсона, расстройство аутистического спектра (РАС), синдром дефицита внимания / гиперактивность (СДВГ), биполярное расстройство, шизофрения и большое депрессивное расстройство) [6, 7, 12–15]. В немногочисленных исследованиях было показано, что бактерии рода Desulfovibrio в образцах кала пациентов с когнитивными и психическими расстройствами представлены в значительно большей концентрации по сравнению со здоровыми пациентами. Интересно, что во всех исследованиях наблюдалась прямая корреляция между концентрацией бактерий Desulfovibrio spp. и тяжестью протекания заболеваний. В независимых исследованиях было показано, что психические и когнитивные расстройства могут иметь общие биомаркеры риска на уровне кишечного микробиоценоза, в роли которых, учитывая распространенность при данных заболеваниях, могут выступать СРБ рода Desulfovibrio [10, 16, 17].

Влияние Desulfovibrio spp. на микробиоценоз кишечника

Основным побочным продуктом метаболизма СРБ в кишечнике является H₂S. Бактерии Desulfovibrio spp. помимо H₂S продуцируют пропионовую кислоту, липополисахарид, магнетит, которые, вероятно, вызывают олигомеризацию и агрегацию белка α-синуклеина, что связано с патогенезом таких заболеваний, как РАС и болезнь Паркинсона. H₂S обладает выраженной генотоксичностью в отношении эпителиальных клеток слизистой оболочки толстой кишки. При более высоких уровнях он может ингибировать окисление бутирата, фагоцитоз, уничтожение бактерий, вызывать гиперпролиферацию, метаболические нарушения в эпителиальных клетках, а также связывать металлы в сульфиды, снижая тем самым биодоступность железа в организме. Некоторые авторы считают, что сероводород может действовать как сигнальная молекула или источник энергии для митохондрий. Более того, используя водород, СРБ помогают в эффективном получении энергии и полном окислении субстратов, продуцируемых ферментативными бактериями. H₂S также продуцируется эндогенно колоноцитами и физиологически активен в головном мозге, сердце, сосудах, мочеполовой системе и ЖКТ на нетоксичных уровнях. Таким образом, СРБ могут играть двойную роль в кишечном микробиоценозе [6, 10]. Эти результаты показывают, что метаболические возможности СРБ, выделенных из толстой кишки человека, неодинаковы и могут зависеть от типа субстрата, доступного в кишечнике, а также от скорости прохождения через пищеварительный тракт [7, 8]. Исследования распространенности бактерий рода Desulfovibrio при помощи ПЦР-амплификации гена 16S рРНК выявили более высокую распространенность СРБ в фекалиях у пожилых людей по сравнению со здоровыми взрослыми, а также положительную корреляцию между численностью Desulfovibrio и курением и отсутствие различий или уменьшения в уровнях Desulfovibrio у больных колоректальным раком по сравнению с людьми, не страдающими колоректальным раком [10]. В связи с тем, что дефицит железа — одна из известных характеристик пациентов с РАС, предполагается, что одним из возможных механизмов действия СРБ у пациентов с РАС является иммобилизация железа в биологически недоступные формы. Повышенное содержание СРБ, включая Desulfovibrio spp., может привести к биоминерализации железа в ЖКТ в виде сульфидов, а менее разнообразная диета препятствует связыванию железа в ЖКТ [10, 13].

Бактерии D. diazotrophicus, также населяющие кишечник млекопитающих, способны к фиксации азота, что способствует их росту в кишечнике [10].

Хотя род Desulfovibrio насчитывает более 60 видов, на сегодняшний день из клинических образцов было выделено только 6: D. desulfuricans, D. fairfieldensis, D. vulgaris, D. piger, D. legallii и D. еnteralis [2, 6]. Среди них D. desulfuricans является наиболее распространенным патогеном, тогда как D. fairfieldensis может быть наиболее вирулентным микроорганизмом, вызывающим инвазивные инфекции [2, 6]. У человека Desulfovibrio spp. могут вызывать такие инфекции, как пародонтит, абсцесс головного мозга, абсцесс печени и инфекцию кровотока [18]. Пациентами с инфекциями Desulfovibrio обычно являются пожилые люди с воспалительными заболеваниями ЖКТ, такими как болезнь Крона, язвенный колит, заболевания гепатобилиарной системы, или с абсцессами другой локализации (абсцесс печени). Ввиду связи СРБ со смешанными инфекциями их трудно идентифицировать, они часто остаются незамеченными, а из-за ограниченного числа зарегистрированных случаев клинические характеристики инфекции еще недостаточно хорошо известны [2, 4].

Инфекции, связанные с Desulfovibrio spp.

На сегодняшний день опубликованы данные о 20 случаях бактериальной инфекции, вызванной Desulfovibrio spp.: 15 из них вызваны D. desulfuricans, 5 — D. fairfieldensis [6, 19–25]. В большинстве случаев Desulfovibrio spp. вызывают абсцессы внутренних органов: брюшной полости (4 случая), печени (3 случая), аппендикса (2 случая), головного мозга (2 случая) и средостения (1 случай). Известно о 3 случаях бактериемии на фоне аппендицита, 3 случаях сепсиса и по 1 случаю перитонита и менингоэнцефалита [2, 3, 18, 25]. Большинство случаев бактериемии D. desulfuricans описаны у пациентов мужского пола. Все пациенты были старше 60 лет, за исключением 1 пациентки, молодой женщины 30 лет. Клинические симптомы разнообразны, но часто наблюдаются желудочно-кишечные проявления. Бактериемии, вызванные СРБ, всегда имели абдоминальное происхождение (вторичное по отношению к аппендициту или внутрибрюшному абсцессу), почти в половине случаев инфекции предшествовали эпизоды диареи, что указывает на то, что бактериемия D. desulfuricans возникла в результате бактериальной транслокации из кишечника или гепаторенальных абсцессов ЖКТ [2–4]. В 12/20 (60,0%) случаях D. desulfuricans был единственным возбудителем, вызывающим бактериемию. Абсцедирование наблюдалось в 5/20 случаях (25,0%). В целом летальность составила 2/20 (10,0% случаев) [2, 4].

Методы детекции и идентификации Desulfovibrio spp.

Были проведены исследования по выделению Desulfovibrio spp. из человеческой крови, гноя, микробиоты влагалища, микробиоты полости рта и микробиоценоза кишечника. Для изучения биологических особенностей Desulfovibrio spp. требуется выделение культур в чистую культуру [7].

Первичную идентификацию СРБ при бактериемии проводили при помощи культивирования гемокультур в аэробных флаконах Standard, и/или Lytic (BACTEC, Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, США), и/или BacT/ALERT (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Франция) в течение 16–72 ч [2, 4]. Однако стоит помнить, что иногда для обнаружения Desulfovibrio spp. в системах крови требуется длительный инкубационный период — до 3–7 дней [4].

Дальнейший фенотипический анализ возбудителей инфекции сводился к исследованию морфологии клеток при окрашивании по Граму, которое выявляло грамотрицательные спиральные или изогнутые палочки, исследованию подвижности микроорганизмов во влажных препаратах, сделанных из центрифугированных концентратов и на среде Sulfide Indole Motility (SIM), а также к исследованию отсутствия сахаролитической активности, тесту на десульфовиридин и на продукцию H₂S [2, 25]. В дополнение к наличию H₂S на среде SIM о наличии Desulfovibrio spp. свидетельствовала красная флуоресценция при щелочном pH под УФ-излучением [2, 4]. Дополнительные тесты, такие как отсутствие роста в 20% желчи и положительная активность уреазы, позволяли идентифицировать бактерии до вида D. desulfuricans, так как это единственный вид с такими характеристиками [2].

Затем содержимое положительных флаконов пересевали на агаризованную среду Brucella с добавлением витамина К₁ (1 мкг/мл) и гемина (5 мкг/мл) и инкубировали при 35–37 °С в анаэробных условиях (6% СО₂) в течение 4 дней [2, 25]. На среде Brucella вырастали маленькие, прозрачные колонии с ровными краями и колонии с γ-гемолитическими свойствами [2]. Далее выросшие колонии идентифицировали до вида с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF MS (BrukerDaltonik^®, Бремен, Германия) [2].

Как было написано ранее, СРБ представляют собой группу анаэробных микроорганизмов, которые могут восстанавливать сульфаты до сульфидов, окисляя многие органические субстраты в качестве доноров электронов, такие как лактат, сукцинат, пируват, ацетат и сахар, образуя жирные кислоты в качестве побочного продукта метаболизма [7]. В связи с этим СРБ, как правило, выделяют с использованием бескислородной лактатно-сульфатной среды, содержащей восстановитель (тиогликолат или аскорбат), а также железо (Fe²⁺), которое реагирует с микробным продуктом анаэробного дыхания — сероводородом (H₂S) с образованием сульфида железа (FeS) в виде нерастворимого пигмента черного цвета [3].

Для изучения микробиоценоза кишечника используют как жидкие, так и агаризованные селективные среды. При изучении бактериологических особенностей Desulfovibrio spp. у детей с РАС в одной из работ была использована жидкая пресноводная среда Видделя и Бака (WB), которая содержала (на 1 л) 4,0 г Na₂SO₄, 0,2 г KH₂PO₄, 0,25 г NH₄Cl, 1 г NaCl, 0,4 г MgCl₂*6H₂O, 0,5 г KCl, 0,113 г CaCl₂, 2 мл раствора витаминов, 1 мл раствора микроэлементов и по 1 мл Na₂SeO₃ (конечная концентрация 23,6 мкМ) и Na₂WO₄ (конечная концентрация 24,2 мкМ) [10]. В другом исследовании скрининг СРБ в кале человека проводили с использованием специальной жидкой среды (Test-kit Labège^®, Compagnie Française de Géothermie, Орлеан, Франция) [26].

L. Sayavedra et al. [27] изолировали Desulfovibrio spp. из клинических образцов кала на анаэробный агар Постгейта C, который содержал на 1 л дистиллированной воды: 6 г лактата натрия, 4,5 г Na₂SO₄, 1 г NH₄Cl, 1 г дрожжевого экстракта, 0,5 г KH₂PO₄, 0,3 г цитрата натрия, 0,06 г MgSO₄*7H₂O, 0,004 г FeSO₄*7H₂O, 4 мл резазурина (0,02% мас./об.), 0,04 г CaCl₂*2H₂O, 0,5 г L-цистеина гидрохлорида и 15 г агара, рН доводили до 7,5±0,1 с помощью 5 М HCl. Чашки Петри инкубировали при 37 °С в течение 2 нед. Стоит отметить, что среда Постгейта часто использовалась для культивирования СРБ из образцов окружающей среды, поэтому эта среда может быть не очень подходящей для выявления Desulfovibrio spp. из кала человека из-за большого разнообразия и сложного состава микробиоценоза кишечника [7].

Y.R. Chen et al. [7] в однофакторном эксперименте оценили воздействие 18 часто используемых компонентов селективных сред на микроорганизмы кишечника человека. Компоненты были разделены на 4 группы: группу доноров электронов, группу акцепторов электронов, группу факторов роста и группу противомикробных агентов. В группу доноров электронов были отнесены крахмал (4 г/л), сукцинат натрия (2 г/л), мальтоза (6 г/л), маннитол (10 г/л), ацетат натрия (5 г/л); в группу акцепторов электронов — сульфат марганца (0,12 г/л), сульфат железа (0,034 г/л) и тиогликонат натрия (0,15 г/л). Факторами роста считались кровь (5%), хемин (0,01 г/л), Tween 80 (1 мл/л), витамины С (0,5 г/л), В₆ (0,001%) и В₁₂ (0,001%). Также авторами для подавления роста чувствительной быстрорастущей микробиоты было предложено добавление противомикробных компонентов метабисульфата натрия (1 г/л), колистина сульфата (0,01 г/л), ванкомицина (0,001 г/л) и рифампицина (0,1 г/л). К данным противомикробным компонентам культуры Desulfovibrio spp. резистентны.

В описанных клинических исследованиях идентификация СРБ на уровне вида была подтверждена с помощью ПЦР-амплификации гена 16S рРНК с использованием различных праймеров и с помощью секвенирования 16S рРНК по методу Сенгера [2].

Согласно данным литературы инфицирование человека Desulfovibrio spp. носит редкий характер, что может быть связано в том числе с низкой выявляемостью инвазии Desulfovibrio spp. Причинами этого могут быть медленная скорость роста культур, сложности в идентификации, особенно когда культура является частью полимикробного сообщества, а также тот факт, что многие лаборатории не проводят рутинное культивирование анаэробных культур. Несмотря на то, что наличие спиральных грамотрицательных палочек при окраске по Граму в культуре крови указывает на Campylobacter spp., оно также должно вызвать подозрение на Desulfovibrio spp. Простые тесты, доступные в большинстве микробиологических лабораторий, такие как влажная подвижность, наличие H₂S на SIM-агаре и наблюдение красной флуоресценции при щелочном pH под УФ-излучением, свидетельствуют о Desulfovibrio spp. Лечение инфекций, вызванных Desulfovibrio spp.

Оптимальное лечение инфекции Desulfovibrio еще не установлено, вероятно, из-за редкой заболеваемости и сложности диагностики инфекций, вызванных D. desulfuricans.

Для лечения инфекции Desulfovirbrio использовали различные терапевтические схемы с применением нескольких классов антибиотиков, включая пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, макролиды и тетрациклины. В нескольких исследованиях при помощи метода эпсилометрии (ETEST^®, bioMérieux) и метода разбавления агара, согласно протоколу Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS), изучалась чувствительность к различным антибиотикам in vitro [2, 3, 25]. Для культивирования и оценки результатов фенотипической чувствительности культур СРБ использовали агар Brucella в качестве основной среды, считывая результаты через 48 ч, и агар Уилкинса — Чалгрена, считывая результаты через 96 ч [25].

Было показано, что D. desulfuricans наиболее чувствителен к метронидазолу, клиндамицину и хлорамфениколу, а также к имипенему, меропенему и ампициллин-сульбактаму [2, 3]. Положительную динамику наблюдали при использовании тазобактама/пиперациллина с последующим внутривенным введением клиндамицина в течение 1 нед. с последующим пероральным приемом метронидазола [4].

Ввиду положительного теста на нитроцефин считается, что D. desulfuricans может продуцировать β-лактамазу расширенного спектра класса А, что делает его устойчивым ко многим цефалоспоринам [2, 3, 25].

По данным литературы, имипенем или метронидазол были предложены в качестве препаратов выбора для эмпирической противомикробной терапии бактериемии, вызванной Desulfovibrio spp., в связи с тем, что эти виды часто выделяют при смешанных аэробно-анаэробных инфекциях [25].

С учетом совпадающей этиологии и механизма различных психических расстройств и когнитивных нарушений, а также выявленной тесной взаимосвязи микробиоценоза кишечника с этими заболеваниями терапия в таких случаях возможна посредством корректировки микробиоценоза кишечника при помощи диеты, антибиотиков, пребиотиков, пробиотиков и трансплантации кишечной микрофлоры [28]. В рандомизированном двойном слепом исследовании с перекрестным дизайном, направленном на оценку эффективности применения пробиотиков для лечения РАС у детей, выявили существенные различия по консистенции стула по сравнению с показателем на фоне приема плацебо и улучшение показателей поведения по сравнению с исходным [29]. Таким образом, воздействие на микробиоценоз кишечника может стать в будущем возможным лечением пациентов с психическими и когнитивными расстройствами.

Заключение

Благодаря достижениям в разработке и применении методов клинической микробиологии D. desulfuricans недавно был признан возбудителем инфекции. Согласно проведенному анализу данных литературы в настоящее время инфекция D. desulfuricans имеет благоприятный прогноз при проведении антимикробной терапии. Однако изучение биологических свойств и разработка новых тест-систем для детекции труднокультивируемых культур Desulfovibrio spp., а также изучение свойств возбудителей инфекции и новых способов лечения пациентов остаются актуальными задачами современной медицины, требующими решения.