ОПИСТОРХОЗ: ВЫБОР ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ | Опубликовать статью ВАК, elibrary (НЭБ)

ОПИСТОРХОЗ: ВЫБОР ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научная статья

Сидельникова А.А.^1, *, Кувшинов Д.Ю.²

¹ ORCID: 0000-0002-0384-0086;

² ORCID: 0000-0003-2055-4724;

^{1, 2} Кемеровский государственный медицинский университет, Кемерово, Россия

* Корреспондирующий автор (alieva-alevtina[at]mail.ru)

Аннотация

Для оценки морфологических, генетических изменений, ранней диагностики и лечения описторхоза в эксперименте изучаются разные виды животных в качестве модели. Основным стандартом служат золотистые хомяки, но также исследования проводились у других видов грызунов – мышей, крыс, а также у кошек. Морфологические изменения у мелких животных могут приобретать иную картину ввиду разницы размеров анатомических структур и размеров мариты паразита. Целью исследования являлась оценка пригодности грызунов (Oryctolagus cuniculus) как модельного животного, по сравнению с золотистыми хомяками (Mesocricetus auratus). Проведен сравнительный анализ клинических проявлений и гистологических изменений печени кроликов (n=16) и золотистых хомяков при инвазионной дозе – 50 метацеркариев Opisthorchis felineus. Клинические признаки инвазии у животных оценивали в течение 1 месяца после заражения, через 35 суток животных выводили из эксперимента и получали гистологический материал печени. Гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином и изучали методом световой микроскопии. Клиническая картина у кроликов к 30 суткам, в отличие от золотистых хомяков, характеризовалась нарушением пигментации шерстяного покрова, бледностью слизистых оболочек, эрозивно-везикулезными поражениями кожи без аллопеции. У кроликов была потеря массы на 12,5-14,28%, у золотистых хомяков наблюдался прирост массы. Поражение органа зрения у кроликов проявлялось как ангулярный фолликулярный конъюнктивит. У обоих видов животных отмечено наличие немотивированного агрессивного поведения. Морфологические изменения были схожи в расширении желчевыводящих путей, метаплазии и инфильтрации эпителия желчных протоков и разрастании аденоматозных структур, при этом у кроликов выявлено наличие мозаичности изменений, инфильтрации междольковой соединительной ткани, в отличие от золотистых хомяков. У обоих видов происходила дистрофия гепатоцитов, но у кроликов эти изменения были неравномерны и не сопровождались некрозом. Таким образом, кролика можно считать пригодной и более чувствительной моделью для формирования описторхоза в эксперименте.

Ключевые слова: эксперимент, описторхоз, кролик, золотистый хомяк, модель.

OPISTHORCHIASIS: SELECTION OF AN EXPERIMENTAL MODEL FOR MORPHOLOGICAL STUDIES

Research article

Sidelnikova A.A.^1, *, Kuvshinov D.Yu.²

¹ ORCID: 0000-0002-0384-0086;

² ORCID: 0000-0003-2055-4724;

^{1, 2} Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russia.

* Corresponding author (alieva-alevtina[at]mail.ru)

Abstract

The current article assesses morphological, genetic changes, early diagnosis and treatment of opisthorchiasis, different animal species as a model in the experiment. The main standard is golden hamsters, but studies have also been conducted in other rodent species such as mice, rats, and cats. Morphological changes in small animals may acquire a different quality due to the difference in the size of anatomical structures and the size of the parasite’s marita. The aim of the study was to assess the suitability of rodents (Oryctolagus cuniculus) compared to golden hamsters (Mesocricetus auratus) as an animal models. The study conducts a comparative analysis of clinical manifestations and histological changes in the liver of rabbits (n=16) and golden hamsters at an invasive dose of 50 metacercariae of Opisthorchis felineus. Clinical signs of invasion in animals were evaluated within 1 month after infection, after 35 days the animals were removed from the experiment and histological liver material was obtained. Histological preparations were stained with hematoxylin-eosin and studied by light microscopy. By day 30, the clinical picture in rabbits, unlike golden hamsters, was characterized by a disturbance in the pigmentation of the coat, pallor of the mucous membranes, erosive-vesicular skin lesions without alopecia. The babbits had a weight loss of 12.5-14.28%, while the golden hamsters had a weight gain. The lesion of the organ of vision in rabbits manifested itself as angular follicular conjunctivitis. The presence of unmotivated aggressive behavior was noted in both animal species. Morphological changes were similar in the expansion of the biliary tract, metaplasia and infiltration of the epithelium of the bile ducts and the proliferation of adenomatous structures; unlike golden hamsters, the rabbits also demonstrated the presence of mosaic changes, infiltration of interlobular connective tissue. In both species, hepatocyte dystrophy occurred; however, in the rabbits, these changes were uneven and were not accompanied by necrosis. The rabbit can be considered a suitable and more sensitive animal model for the formation of opisthorchiasis in the experiment.

Keywords: experiment, opisthorchiasis, rabbit, golden hamster, model.

Введение

Золотистые хомяки являются наиболее популярным видом для моделирования описторхоза [1, С.155], [7, С.60], [19, C.10]. Недостатками проведения эксперимента на золотистых хомяках можно считать небольшой вес животного, узкие желчевыводящие пути и маленький объем желчного пузыря. Размер мариты Opisthorchis felineus составляет 4-13 мм в длину и 1-3 мм в ширину, производят около 1000 яиц в сутки [12, С.126]. Кроме того размер мариты может варьировать в зависимости от вида хозяина (у хомячков больше, чем у собак и кошек) и от числа особей [11, С. 120], [16, С.67]. При этих биологических параметрах интоксикация наступает быстрее, ее проявления более выражены. Желчные протоки повреждаются в большей степени, быстрее происходит их окклюзия. При условии выбора для моделирования описторхоза кроликов как более крупных грызунов, комплекс морфологических изменений, подтверждающихся клинической картиной, представляется нагляднее. Оба вида животных относят к грызунам, имеющим в основном растительный рацион. Это характеризует данную модель как условную, поэтому может различаться реакцией организма на инвазию при ином типе отдельных метаболических процессов, отдельных структурно-функциональных особенностях органов и тканей. Тем не менее, в рационе кроликов может оказаться речная рыба или ее продукты, предлагаемая в качестве докорма ослабленным или лактирующим животным [2, С.47].

Методы и принципы исследований

Целью исследования являлась оценка пригодности грызунов (Oryctolagus cuniculus) как модельного животного, по сравнению с золотистыми хомяками (Mesocricetus auratus). Наблюдение проведено на животных (кролики, самцы половозрелого возраста) (n=16). Кролики были заражены перорально, в дозе по 50 метацеркариев Opisthorchis felineus, в утренние часы, натощак. Выделение метацеркариев из мышечной ткани рыб (язь и подъязки (Leuciscus idus)), полученных из р.Томь, проводили вручную, с помощью компрессориума. За счет этого определяли жизнеспособность личинок, отбирая лишь совершавших маятникообразные движения в капсуле. Обследование зараженных животных проводили через один месяц. Выбор срока обусловлен данными литературы, 3-5 часов миграции в желчевыводящие пути и развитие до мариты за 25-30 дней [3, С.178]. В качестве контроля использованы данные литературы, полученные у золотистых хомяков при той же степени заражения (50 метацеркариев) [7, С.60]. Морфологическое исследование печени проведено у животных, выведенных из эксперимента через 35 суток. Гистологические препараты изготовляли путем проведения через батарею спиртов восходящей концентрации, подготовкой к пластификатору с помощью ксилола ЧДА, пластификацией Гистомиксом, изготовлению ультратонких срезов, толщиной 4 мкм, с помощью санного микротома, и последующим окрашиванием бихромным способом основным красителем гематоксилином Эрлиха, кислым красителем – водным раствором эозина. Завершение изготовления гистологических препаратов проведено дифференцировкой в ксилоле и заключением в полистерол. Изучение гистологических препаратов проведено путем световой микроскопии при увеличении ×40, ×100, ×400 на световом микроскопе Primo Star Zeizz (Германия).

Основные результаты и обсуждение

Через месяц после заражения для подтверждения выбран лабораторный метод исследования кала на обнаружение яиц паразитов. Методами Като-Миура и Paracep установлено наличие яиц в экскрементах при трехкратном анализе. Положительный результат подтверждает, что паразит развивается до состояния мариты в организмах данных животных. Соответственно, новая модель, кролик, как и золотистый хомяк, подходит для моделирования данного типа инвазии.

Одним из отличий дизайна эксперимента послужило то, что метацеркарии описторхов в нашем эксперименте не имели повреждений, так как животные получали неинцистированные личинки. Важно то, что они попадали в желудок кроликов сразу, без предварительной инцистирования в искусственном желудочном соке. Вероятно, эндогенные факторы организма способствуют повышению двигательной активности личинок, тогда как искусственная среда может несколько снижать эти показатели, хотя это может оставаться предметом исследований.

При клиническом осмотре было установлено появление везикулярного поражения кожи с локализацией только на спине, по боковым поверхностям вдоль позвоночника. Данных об аналогичном поражении кожных покровов у хомяков нет. Однако, даже без лечения у кроликов происходит некоторое восстановление кожных покровов после месяца инвазии. Уже после 34 суток мы наблюдали эпителизацию дефектов и их частичное отсутствие. Однако, полное исчезновение везикул, язв и трещин наблюдается в течение 1,5-2 месяцев. Инвазия у кроликов сопровождается аллергическим компонентом, что подтверждается кожным зудом в основном в области микроциркуляторного русла – на ушах [14, С.376]. У хомяков, как иной модели описторхоза, происходили изменения в виде облысения спустя 30 суток после заражения [7, С. 62]. Аллопеции у кроликов в пределах того же срока не отмечали.

После первого месяца инвазии у кроликов отмечали потерю пигментации волосяного покрова, что характеризует нарушение пигментного обмена, проявляемого в нарушении накапливать стержневой частью волоса меланин и его осветление. Возможно, это связано с нарушением способности накапливать кератиноцитами пигмента. Причиной нарушения пигментации также может быть поражение меланоцитов матрицы волоса, так и угнетение в них синтеза пигмента под влиянием эндокринных изменений.

Однако, у животных была отмечена потеря массы тела на 12,5-14,28% в течение первого месяца инвазии. У мышей и хомячков через 30 суток после заражения, напротив, был обнаружен прирост массы тела, хотя и в незначительных значениях; у последних в меньшей степени [1, С.158].

Кроме того, отмечались проявления со стороны слизистых оболочек полости рта – выраженная бледность слизистой части губ, щек, десен, языка, причиной чего была лабораторно-подтвержденные гипохромная анемия, пойкилоцитоз. При этом, анизоцитоз для кроликов является вариантом нормы.

Со стороны органов зрения у кроликов отмечался аллергический ангулярный конъюнктивит с формированием фолликулов, гиперемией конъюнктивы преимущественно верхнего века [15, С.80]. Конъюнктива нижнего века не имела подобных изменений, хотя пути оттока, как правило, способствуют его патологическим изменениям при вирусных или бактериальных инфекциях. У хомяков поражение органов зрения большинством авторов не рассматривались, вероятно, ввиду небольших размеров органа зрения или из-за скудности проявлений такие изменения оставалось незамеченным.

Также у зараженных животных было обнаружено изменение поведения, проявляемое в виде агрессии на привычные раздражители, быстро меняющееся на угнетенное состояние. У золотистых хомячков в тот же срок отмечались адинамия и агрессивность [5, С.167]. Вероятно, это проявление нейроинтоксикации, провоцируемое распадом собственных клеток и выделяемых эндотоксинов, в некоторой степени – самим паразитом. Особую роль при поражении ЦНС играет аммиак как важнейший нейротоксический медиатор [10, С. 46]. Его существенное образование происходит в печени вследствие дезаминирования аминокислот [4, С. 5-7]. В меньшей степени аммиак участвует в синтезе глутамина в перивенозных гепатоцитах [9, С. 43]. Также при раннем поражении печени, как известно, происходит латентная печеночная энцефалопатия [17, С. 690], проявления которой со стороны нервной системы довольно относительные и дискуссионные.

Важно отметить, что при описторхозе у кроликов отмечали изменение пищевого поведения, что является признаком идиосинкразии. Так, в ранние сроки наблюдения животные предпочитали корм богатый белками, а к концу срока наблюдения предпочитали растительные корма. У хомяков признаки нарушения пищевого поведения в научной литературе не встречаются.

При изучении гистологических препаратов печени животных обнаружен ряд структурных изменений. Междольковая соединительная ткань окружала печеночные дольки по периметру, в ней обнаружены как тонкие коллагеновые волокна, так и грубые широкие пучки волокон, расцененные как гипертрофия. В ней обнаружена полиморфно-клеточная инфильтрация. В составе инфильтрата диагностировались лимфоциты, гигантские многоядерные клетки, сегментоядерные нейтрофилы, плазматические и тучные клетки. Тучные клетки имели частичную дегрануляцию цитоплазмы. У значительно расширенных желчных протоков портальных трактов отмечено наличие сформированных мелких коллатералей – протоков малого калибра. Изменение эпителия междольковых желчных протоков характеризовался участками лимфоцитарной инфильтрации, метаплазии, чередующиеся с неизмененными участками эпителия. В стенке некоторых из протоков обнаружены клетки типа мукоцитов слюнных желез. Они имели светлую цитоплазму, высокопризматическую форму, плоское ядро в базальном полюсе. Расположение в стенке желчного протока мукоцитоподобных клеток отмечали по типу секреторных концевых отделов. Выявлялись изменения размеров ядра гепатоцитов в виде микроядер, а также двуядерные клетки с гипохромией второго ядра. В цитоплазме отдельных гепатоцитов отмечалось отсутствие оксифильной зернистости, окраска цитоплазмы других гепатоцитов отсутствовала. Неравномерное изменение гепатоцитов наблюдали лишь в области периферии дольки, при сохранности гепатоцитов центральной части. Визуально фиксировалось уменьшение размеров гепатоцитов за счет расширенных синусоидных капилляров, в других участках органа отмечена сохранность структур.

Гистологическое исследование печени золотистых хомяков в тот же срок обнаруживало сходные изменения: расширенные желчевыводящие протоки, метаплазию эпителия желчных протоков, наличие аденоматозных структур [1, С.161], [18, C. 934]. Однако, в этом случае, отсутствовала мозаичность изменений в протоках, как у кроликов. Кроме того у хомяков выявлялась только инфильтрация желчных протоков [13, С. 16], тогда как у кроликов инфильтрация была как в междольковой соединительной ткани, так и в эпителии желчных протоков. В гепатоцитах хомяков обнаружены признаки дистрофии, увеличение числа одноядерных и двуядерных клеток, некроз [8, С.80]. У кроликов изменения ядер и цитоплазмы были неравномерны, клетки с измененным ядерным аппаратом и цитоплазмой чередовались с клетками без выраженных структурных изменений, некроз отсутствовал.

Неравномерные изменения долек печени, портальных трактов или эпителия протоков у кроликов могли быть связаны с постепенным развитием структурно-функциональных нарушений в сроки наблюдения. Морфологическая перестройка гепато-билиарной системы тесно связано с патогенезом описторхоза, где пусковыми факторами являются и молекулы, выделяемые паразитом, и воспалительные, иммунопатологические, молекулярно-генетические механизмы хозяина [20, C. 97]. Через 4 недели после заражения невозможно утверждать только об одном типе морфологических изменений в печени и желчевыводящих путях ввиду длящейся структурной перестройкой, связанной с репаративной регенерацией, дифференцировкой клеток. Исходя из этого, кролики по сравнению с хомячками являются более чувствительной моделью по отношению к влиянию паразита. Аналогичные изменения с высокой долей вероятности происходят и у человека, постепенно приводя к структурным изменениям желчевыводящих протоков и самого органа [6, С. 125]. Это объясняет переход процесса в хроническую фазу, при которой постепенно вовлекаются все новые участки органа.

Заключение

При относительной сходности клинических проявлений кролик является более восприимчивым организмом, чем золотистый хомяк, о чем свидетельствуют выраженные аллергические реакции кожи и слизистых органа зрения, специфические кожные изменения, идиосинкразии при экспериментальном описторхозе. Гистологические изменения желчных протоков и гепатоцитов кроликов характеризуются мозаичностью, частичной сохранностью эпителия и печеночной паренхимы, что обусловлено большим размером органа локализации и волнообразным протеканием структурных изменений. В отношении метаплазии и наличия аденоматозных структур в эпителии желчных протоков печени оба вида идентичны. Психомоторные реакции обоих видов животных также сходны.

Таким образом, кролики, по сравнению с хомячками, являются, по нашему мнению, более восприимчивой моделью экспериментального описторхоза, что подтверждается как клиническими, так и морфологическими данными.

Благодарности Авторы выражают благодарность за помощь на начальном этапе работы сотрудникам ООО «Ветеринарная скорая помощь».	Acknowledgement The authors express their gratitude for the help at the initial stage of work to the employees of Veterinary Ambulance LLC.
Конфликт интересов Не указан.	Conflict of Interest None declared.