АКТИВНОСТЬ ТРОМБОЦИТАРНЫХ ФЕРМЕНТОВ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ И ГЛУТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗЫ У МУЖЧИН И ЖЕНЩИН В РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУППАХ | Опубликовать статью ВАК, elibrary (НЭБ)

АКТИВНОСТЬ ТРОМБОЦИТАРНЫХ ФЕРМЕНТОВ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ
И ГЛУТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗЫ У МУЖЧИН И ЖЕНЩИН В РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУППАХ

Научная статья

Прохорова Т.А.¹, Терешкина Е.Б.², Савушкина О.К.^3, *, Бокша И.С.⁴, Воробьева Е.А.⁵, Бурбаева Г.Ш.⁶

¹ ORCID: 0000-0002-3574-2165;

² ORCID: 0000-0002-4784-8995;

³ ORCID: 0000-0002-5996-6606;

⁴ ORCID: 0000-0003-1369-8658;

⁵ ORCID: 0000-0002-5766-0910;

⁶ ORCID: 0000-0001-7744-533X;

^1-6 Научный центр психического здоровья (ФГБНУ НЦПЗ), Москва, Россия;

⁴ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи, Москва, Россия

* Корреспондирующий автор (osavushkina[at]yandex.ru)

Аннотация

Обоснование – активные формы кислорода (АФК) имеют жизненно важное значение для функционирования тромбоцитов– они участвуют в активации, агрегации и рекрутинге тромбоцитов, регулируя внутриклеточные сигнальные пути. Возрастные изменения, происходящие в тромбоцитах на молекулярном уровне, практически не изучены, хотя показано, что с возрастом изменяется функциональная активность тромбоцитов.

Цель исследования – оценить возрастные различия активности глутатионредуктазы (GR) и глутатион-S-трансферазы (GST) в тромбоцитах мужчин и женщин.

Материал и методы – в исследование были включены 55 мужчин и 37 женщин трех возрастных подгрупп: молодого (20 – 35 лет), среднего (36 – 59 лет) и пожилого возраста (старше 60 лет). Ферментативную активность GR и GST определяли спектрофотометрически.

Результаты – у женщин обнаружено достоверное снижение активности GST в подгруппе среднего возраста по сравнению с подгруппой молодых женщин (р=0,035). Достоверных различий активности GST между подгруппами среднего и пожилого возраста, а также молодого и пожилого возрастов не выявлено. У мужчин достоверных различий активности GST между возрастными подгруппами не обнаружено. В общей группе активность GST у женщин оказалась достоверно ниже, чем у мужчин. При сравнении активности GR между отдельными возрастными подгруппами только у мужчин и только у женщин достоверных различий не выявлено. Различий активности GR между мужчинами и женщинами также не обнаружено ни в одной возрастной подгруппе.

Заключение – полученные данные могут быть использованы в исследованиях тромбоцитарных GR и GST при заболеваниях, в патогенезе которых играет важную роль окислительный стресс.

Ключевые слова: глутатионредуктаза, глутатион-S-трансфераза, тромбоциты, окислительный стресс.

ACTIVITY OF PLATELET ENZYMES GLUTATHIONE REDUCTASE
AND GLUTATHIONE-S-TRANSFERASE IN MALES AND FEMALES OF DIFFERENT AGE GROUPS

Research article

Prokhorova T.A.¹, Tereshkina E.B.², Savushkina O.K.^3, *, Boksha I.S.⁴, Vorobyova E.A.⁵, Burbaeva G.Sh.⁶

¹ ORCID ID: 0000-0002-3574-2165;

² ORCID ID: 0000-0002-4784-8995;

³ ORCID ID: 0000-0002-5996-6606;

⁴ ORCID ID: 0000-0003-1369-8658;

⁵ ORCID ID: 0000-0002-5766-0910;

⁶ ORCID ID: 0000-0001-7744-533X;

^1-6 Mental Health Research Center (MHRC), Moscow, Russia;

⁴ N. F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

* Corresponding author (osavushkina[at]yandex.ru)

Abstract

The relevance of the study: reactive oxygen species (ROS) are vital for platelet functions. They are involved in platelet activation, aggregation and recruitment through regulating intracellular signaling pathways. Age-related changes in platelets at the molecular level have not been practically studied, although it has been shown that the functional activity of platelets changes with age.

The aim of the study is to evaluate age-related differences in the activity of glutathione reductase (GR) and glutathione-S-transferase (GST) in platelets of males and females.

Material and methods — the study included 55 males and 37 females of three age groups: young (20-35 years), middle-age (36 – 59 years) and elderly (over 60 years). The enzymatic activity of GR and GST was determined spectrophotometrically.

The Results of the study demonstrate that the females in the middle-aged subgroup show a significant decrease in GST activity compared to the younger female subgroup (p=0.035).  There are no significant differences in GST activity between the middle-aged and elderly subgroups as well as the young and elderly subgroups. In males, there are no significant differences in GST activity between age subgroups. In the mixed group, GST activity in females is significantly lower than in males. There are also no significant differences to be found when comparing the activity of GR between individual age subgroups only in males and only in females. The differences in GR activity between males and females are also not found in any age subgroup.

The research concludes that the obtained data can be used to study platelet GR and GST in those diseases where oxidative stress plays an important role in the pathogenesis.

Keywords: glutathione reductase, glutathione-S-transferase, platelets, oxidative stress.

Введение

В последние годы появляется все больше доказательств того, что образование активных форм кислорода (АФК) в организме необходимо для нормального функционирования клеток. АФК регулируют клеточные сигнальные пути, участвующие как в физиологических, так и патологических процессах [1]. Механизмы регуляторного действия АФК исследуются. Одним из возможных механизмов регуляции сигнальных путей со стороны АФК является окисление остатков цистеина на сигнальных белках [2]. Недавно было установлено, что АФК имеют жизненно важное значение для функционирования тромбоцитов– они участвуют в активации, агрегации и рекрутинге тромбоцитов, регулируют внутриклеточные сигнальные пути [3].

Тромбоциты – небольшие безъядерные клетки, образующиеся при фрагментации мегакариоцитов в костном мозге. Они играют важную роль в гемостазе, образовании тромбов, воспалении и иммунном ответе [4], а также в значительной степени способствуют развитию заболеваний, характеризующихся чрезмерной активацией тромбоцитов. При физиологических условиях тромбоциты на активирующие стимулы отвечают функциональной триадой: адгезией, активацией и агрегацией. Адгезия тромбоцитов опосредуется взаимодействием тромбоцитарного гликопротеина VI (GPVI) и GPIbα с коллагеном и фактором Виллибранда (VWR), соответственно [5]. Этот процесс запускает активацию тромбоцитов, характеризующуюся перестройкой цитоскелета и мембран, изменением формы, мобилизацией кальция, активацией тромбоцитарного интегрина αIIbα3 (GPIIb–IIIa), дегрануляцией и экстернализацией фосфатидилсерина [5].

Тромбоциты являются как источником, так и мишенями АФК. Тромбоциты могут генерировать АФК, такие как супероксид-анионы, гидроксильные радикалы и пероксид водорода [6], [7]. Основными источниками АФК в тромбоцитах являются изоформы NAD(P)H-оксидаз (NOX), циклооксигеназа, ксантиноксидаза и дыхательная цепь митохондрий [7]. На базовом уровне продукция АФК в тромбоцитах осуществляется изоформами NOX1/2 и дыхательной цепью митохондрий. Быстрое повышение уровня продукции АФК происходит при стимуляции GPVI [3]. При патологических состояниях, таких как, сахарный диабет, рак, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания и психические расстройства, когда наблюдается окислительный стресс, тромбоциты становятся мишенью действия экзогенных АФК. Это может иметь разные патологические последствия, например, усиление апоптоза тромбоцитов и, следовательно, тромбоцитопения и кровотечения, или же гиперактивация и, следовательно, усиление образования тромбов и тромбоэмболии [8].

Поскольку при активации тромбоцитов образуются АФК, которые, в свою очередь, усиливают активацию тромбоцитов, система антиоксидантной защиты не только предотвращает цитотоксическое действие АФК, но и регулирует сигнальные пути в тромбоцитах [9]. Как известно, важную роль в поддержании окислительно-восстановительного баланса в клетках играет ферментативная антиоксидантная система глутатиона. Глутатион (GSH) используется в качестве кофактора в окислительно-восстановительных реакциях, в которых восстанавливается пероксид водорода и органические пероксиды с помощью глутатионпероксидазы (GPx) и образуется окисленный димер глутатиона (GSSG), или в реакциях глутатион-S-трансферазы (GST). В свою очередь, глутатионредуктаза (GR) восстанавливает GSSG до GSH с использованием НАДФ-Н в качестве донора электронов.

В данной работе рассматриваются два наименее изученных фермента антиоксидантной глутатион-зависимой защиты тромбоцитов: GR и GST. В литературе практически нет данных об уровне этих ферментов в тромбоцитах человека в зависимости от пола и возраста. В связи с тем, что мы обнаружили статистически значимые изменения активности этих ферментов в тромбоцитах лиц с психическими патологиями при сравнении с уравненными по полу и возрасту контрольными группами [10], [11], [12], представляется важным прицельно изучить зависимость этих параметров от пола и возраста у психически здоровых лиц.

Цель настоящего исследования – исследование зависимости активности тромбоцитарных ферментов GR и GST от пола и возраста у здоровых волонтеров. 

Материалы и методы

Исследование проводилось с одобрения Этического комитета ФГБНУ НЦПЗ (Протокол N8 от 26.02.2019) с соблюдением современных этических норм и правил биомедицинских исследований в соответствии с Хельсинским соглашением Всемирной медицинской ассоциации (в редакциях 1975/2000 г). Все участники исследования подписали информированное согласие на участие в исследовании. Обследовано 55 мужчин в возрасте 20 – 73 года и 37 женщин 20 – 81 года. Участники исследования были разделены на 3 подгруппы в соответствии с их возрастом: подгруппа молодого возраста, 20 – 35 лет (n=38, 24 мужчины, 14 женщин), подгруппа среднего возраста, 36 – 59 лет (n=41, 27 мужчин, 14 женщин), подгруппа пожилого возраста, старше 60 лет (n= 13, 4 мужчин, 9 женщин) [13].

Взятие образцов крови из локтевой вены проводилось в вакутейнеры с 3,2% цитратом натрия (5 мл). Из образцов крови в течение 2 часов выделяли тромбоциты и готовили экстракт, как описано ранее [10]. Активности анализируемых ферментов определялись кинетическими методами с использованием планшетного спектрофотометра xMark (Bio-Rad). Активность GR определялась по окислению NADPH (по убыли поглощения, регистрируемого при 340 нм) в реакции восстановления GSSG [12]. Активность GST определялась по скорости образования хромогенных конъюгатов GSH с 1-хлоро-2,4-динитробензолом (нарастанию поглощения, регистрируемого при 340 нм) [12]. После определения концентрации белка по методу Лоури для всех ферментов рассчитывали удельную активность.

Проверка гипотезы о нормальном распределении данных (активности GR и GST) критерием Шапиро-Уилка показала, что данные не подчиняются закону нормального распределения. Для оценки достоверности различий, изменений параметров и связей между ними применялись методы непараметрической статистики: U-тест Манна-Уитни, метод Краскел-Уоллиса, вычисление коэффициентов ранговых корреляций Спирмена (R). Различия и корреляции считали достоверными при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Результаты определения активности GR и GST в тромбоцитах у мужчин и женщин трех разных возрастных подгрупп приведены в таблице.

У женщин обнаружено достоверное снижение активности GST в подгруппе среднего возраста по сравнению с подгруппой молодых женщин (р=0,035). При сравнении подгруппы среднего возраста с подгруппой пожилых женщин наблюдается тенденция к повышению активности, но различия активности GST между этими двумя подгруппами недостоверны. Активность GST в подгруппах молодых и пожилых женщин достоверно не различается.

У мужчин достоверных различий активности GST между возрастными подгруппами не выявлено (метод Краскел-Уоллиса, р>0,3).

В общей группе (55 мужчин и 37 женщин) активность GST у женщин оказалась достоверно ниже, чем у мужчин. При этом сравнение активности GST в соответствующих возрастных подгруппах мужчин и женщин показало, что достоверные различия активности присутствуют только между подгруппами среднего возраста (U-тест Манна-Уитни, р<0,001).

 

Таблица 1 – Активность GR и GST в разных возрастных подгруппах у мужчин и женщин

	Возрастные подгруппы
	Молодая подгруппа 20-35 лет		Средняя подгруппа 36-59 лет		Пожилая подгруппа 60-81 год
	Мужчины (n=24)	Женщины (n=14)	Мужчины (n=27)	Женщины (n=14)	Мужчины (n=4)	Женщины (n=9)
Возраст, лет	24,5±4,5	22,48±3,7	46,2±7,3	52,7±4,1	68,5±6,4	66,2±6,9
GR, U/мг	10,14±2,20	8,99±1,30	10,34±3,15	10,61±3,50	10,19±1,11	9,65±2,84
GST, U/мг	21,09±5,90	17,63±4,38	19,12±4,41	13,79±3,21*#	15,21±5,65	16,11±2,02

Примечание: *- достоверные различия между мужчинами и женщинами, р<0,001; ^#– достоверные различия между женщинами молодого и среднего возраста у женщин, p<0,05

При сравнении активности GR между отдельными возрастными подгруппами только у мужчин и только у женщин достоверных различий не выявлено (метод Краскел -Уоллиса, р>0,3). Различий активности GR между мужчинами и женщинами также не обнаружено ни в одной возрастной подгруппе.

Известно, что старение связано с окислительным стрессом, приводящим к нарушению редокс-сигналинга и/или к повреждению макромолекул [14], [15]. Опубликовано мало данных по изменению функции тромбоцитов в процессе старения, и возрастные изменения, происходящие в тромбоцитах на молекулярном уровне, практически не изучены, хотя показано, что с возрастом изменяется функциональная активность тромбоцитов [16]. Обнаружено (Jain K et al, 2019), что в тромбоцитах людей среднего (40-59 лет) и пожилого (60-79 лет) возраста продукция внутриклеточных АФК повышается. Кроме того, с возрастом значительно снижается соотношение GSH/GSSG, отражающее редокс-статус клеток, и снижается уровень экспрессии каталазы и супероксиддисмутазы [17].

Метаболизм глутатиона и редокс-сигналинг зависят от пола [18]. Восстановление GSSG до GSH катализирует GR, которая отвечает за поддержание соотношения GSH/GSSG. Половые различия активности GR обнаружены в печени и мозге животных и в эритроцитах человека при различных заболеваниях [18]. В нашей работе на тромбоцитах человека не выявлено возрастных и половых различий в активности GR.

Значительная роль в клеточных редокс-зависимых процессах также принадлежит GST, которая катализирует конъюгацию GSH c неполярными соединениями эндогенного и экзогенного происхождения, содержащими электрофильные атомы углерода, серы, азота и фосфора [19], а также с органическими гидроперекисями [19] и защищает клетки от возможного токсического действия этих соединений. Rogerson K.S. et al (1984) показали, что средняя активность GST в тромбоцитах у женщин ниже, чем у мужчин. Ферментативную активность эти авторы определяли у группы волонтеров в широком возрастном интервале (от 18 до 80 лет). Интересно, что нормальному распределению подчинялась только активность GST у мужчин [20]. В нашей работе тоже продемонстрирована более низкая активность тромбоцитарной GST у женщин по сравнению с мужчинами, что согласуется с данными авторов цитированной статьи. Кроме того, в нашей работе у женщин обнаружен возрастной период, в котором снижена активность GST, что возможно, объясняется гормональными факторами. Это может служить объяснением тому факту, что данные об активности GST у женщин (в целом, с охватом всех возрастных групп), в отличие от мужчин, не подчиняются закону нормального распределения. Тромбоциты человека (как мужчин, так и женщин) имеют рецепторы 17β-эстрадиола и регуляторные белки, а также рецепторы андрогенов и прогестерона [21], [22]. Однако нет данных о взаимосвязи стероидных гормонов и регуляции антиоксидантных ферментов тромбоцитов.

Полученные в настоящей работе сведения могут быть полезны в исследованиях тромбоцитарных GR и GST при заболеваниях, в патогенезе которых играет важную роль окислительный стресс, например, при исследовании этих тромбоцитарных ферментов при психических патологиях.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.