ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ГОРНЫХ ПОРОД ПРИРОДНЫХ БИОМИНЕРАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ КАВКАЗСКОГО БИОСФЕРНОГО ЗАПОВЕДНИКА НА ИХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА | Опубликовать статью ВАК, РИНЦ

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ГОРНЫХ ПОРОД ПРИРОДНЫХ БИОМИНЕРАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ КАВКАЗСКОГО БИОСФЕРНОГО ЗАПОВЕДНИКА НА ИХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

Научная статья

Подчасова Т.А.^1, *, Закалюкина Ю.В.², Бирюков М.В.³, Григорьева И.Ю.⁴

^{1, 2, 3, 4} Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия.

* Корреспондирующий автор (taniasimple[at]gmail.com)

Аннотация

Цель

Целью данной работы является анализ влияния минерального состава пород, потребляемых дикими копытными животными на территории Кавказского государственного биосферного заповедника на их антибактериальные свойства.

Методы

Гранулометрический состав пород определялся ситовым методом по ГОСТ 12536-2014, минеральный состав пород определялся методом рентгеновской дифрактометрии. Оценка численности и разнообразия комплекса актиномицетов осуществлялась методом посева водных суспензий образцов на плотную питательную среду. Первоначальное дифференцирование культур проводили на основе изучения морфологических признаков колоний в оптическом микроскопе. Филогенетическое исследование выделенных штаммов проводили на основе анализа фрагментов 16S рРНК, и сопоставления их с аналогичными фрагментами из базы данных GenBank. Скрининг на наличие антибиотической активности проводился in vitro методом лунок.

Результаты

Установлена приуроченность наибольшей численности прокариот к более мелкой фракции отобранных образцов (менее 1 мм), представленной в основной массе глинистыми минералами – иллитом, смектитом и каолинитом. В данной фракции наблюдается большое количество стрептомицетов, обладающих антагонистической активностью к патогенным микроорганизмам и гельминтам. Заключение. В процессе развития актиномицеты накапливают и/или выделяют во внешнюю среду вторичные метаболиты, обладающие антагонистическими свойствами в отношении других прокариот (антибиотики). Поедание животными горных пород, с активно развивающимися в них актиномицетами, может являться способом профилактики или лечения расстройств желудочно-кишечного тракта. Обнаружить в горных породах зоны, где активно развиваются актиномицеты, животные могут, ориентируясь на запах геосмина – летучего органического вещества терпеновой природы.

Ключевые слова: геофагия, актиномицеты, стрептомицеты, кавказский заповедник, природный биоминеральный комплекс, копытные животные.

INFLUENCE OF COMPOSITION OF ROCKS OF NATURAL BIOMINERAL COMPLEXES OF THE CAUCASUS NATURE RESERVE ON THEIR ANTIBACTERIAL PROPERTIES

Research article

Podchasova T.A.^1, *, Zakalyukina Yu.V.², Biryukov M.V.³, Grigorieva I.Yu.⁴

^{1, 2, 3, 4} Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia

* Corresponding author (taniasimple[at]gmail.com)

Abstract

The aim of this work is to analyze the influence of the mineral composition of rocks consumed by wild ungulate animals in the territory of the Caucasus Nature Reserve on their antibacterial properties.

Methods

The granulometric composition of the rocks was determined by means of the sieve method according to GOST 12536-2014, the mineral composition of the rocks was determined with the help of x-ray diffractometry. The abundance and diversity of the actinomycete complex was estimated by the method of inoculating aqueous suspensions of samples on the solid nutrient medium. The initial differentiation of cultures was carried out on the basis of examining the morphological features of colonies in the optical microscope. A phylogenetic study of the isolated strains was performed by means of the analysis of 16S rRNA fragments and their comparison with similar fragments from the GenBank database. Screening for antibiotic activity was performed invitro by the volume displacement method.

Results

The confinedness of the largest number of prokaryotes to a smaller fraction of the selected samples (less than 1 mm) represented in the bulk by clay minerals – illite, smectite and kaolinite, was established. In this fraction, a large number of streptomycetes with antagonistic activity against pathogenic microorganisms and helminths is observed. Conclusion. During the development of actinomycetes, secondary metabolites are accumulated and/or secreted into the environment and they have antagonistic properties against other prokaryotes (antibiotics). The fact that animals eat rocks with actinomycetes actively developing in them can be a way of preventing or treating disorders of the gastrointestinal tract. Animals can detect zones in the rocks where actinomycetes are actively developing with the help of the smell of geosmin – a volatile organic substance of terpene nature.

Keywords: geophagy, actinomycetes, streptomycetes, Caucasus Nature Reserve, natural biomineral complex, ungulate animals.

Введение

Во многих горных регионах мира растительноядные животные периодически употребляют в пищу горные породы и минерализованные воды подземных источников. В научной литературе данный феномен обозначается термином – геофагия (geophagy) или литофагия. Поедание минеральных веществ осуществляется обычно в одних и тех же местах и сопровождается формированием характерных ландшафтных объектов – природных биоминеральных комплексов (БМ-комплексов). Данные объекты обозначаются различными авторами, как – солонцы, кудюры или кудуры [1], [2], [3]. В англоязычной литературе такие объекты обозначаются термином mineral licks [4]. Для познания причин употребления горных пород в пищу дикими животными различными авторами [5], [6], как правило, проводятся исследования химико-минерального состава пород. На основе данных об их составе выдвигается та или иная гипотеза, объясняющая причины использования животными пород природных биоминеральных комплексов в пищу. Так, были выдвинуты натриевая [7], [4], [8], микроэлементная [9], адсорбционная [10], [6], [11], редкоземельная [12] и ряд других гипотез.

В последнее время появилась и так называемая «микробиологическая» гипотеза геофагии, основанная на наличии высокой численности мицелиальных прокариот (представителей порядка Actinomycetales, продуцирующих две трети всех ныне известных антибиотиков) в верхнем выветрелом горизонте горных пород. Подобные предположения были высказаны при анализе термитников, потребляемых шимпанзе в Национальном Парке, Махали Маунтинс [13], [14].

Для установления возможных гипотез потребления горных пород БМ-комплексов дикими копытными животными на территории Кавказского заповедника, в 2017 году были проведены полевые работы и отобраны образцы пород. В данной статье приводятся и обсуждаются результаты проделанной работы.

Материалы и методы

В результате полевых исследований были отобраны пробы пород на двух природных биоминеральных комплексах, образованных на склонах горы Алоус (рис. 1), расположенной в центральной части Кавказского природного биосферного заповедника.

Внешне комплексы похожи и представляют собой серии почти изометричных, освобожденных от растительности и почвы, выбитых копытами животных, площадок на задернованных горных склонах, соединенных между собой звериными тропами (рис. 2, 3А). Размеры таких площадок от 3 до 20 м в поперечнике и до полуметра глубиной с характерными нишами выедания в подпочвенных горизонтах (рис. 3В). На площадках присутствуют свежие отпечатки копыт серн (Rupicapra rupicapra caukasica) и кубанских туров (Capra caucasica), а также экскременты и шерсть животных.

Данные комплексы ежегодно посещаются сотрудниками заповедника, с целью подсчета численности копытных на территории, однако специальных наблюдений за поведением животных пока не проводилось. Известно лишь, что данные БМ-комплексы привлекают преимущественно кавказских туров. Животные начинают их посещать сразу после стаивания снега, периодически наведываясь в течение всего бесснежного периода.

Рис. 1 – Геологическая схема района исследований (на основе геологической карты РФ К-37-V, 2002), на врезке местоположение района исследований в пределах территории Кавказского государственного природного биосферного заповедника

 

Рис. 2 – Внешний вид (общий) БМ-комплекса №1

 

Рис. 3А – Внешний вид (общий) БМ-комплекса №2

Рис. 3В – Ниши выедания в подпочвенных горизонтах, БМ-комплекс №2

 

На БМ-комплексе №1 и №2 было отобрано методом конверта по 2 обобщенных пробы рыхлых горных пород. Пробы отбирались из лизунцовых ниш (расположенных обычно в прикорневой части травяной растительности) с глубины 0-3 см и 10-15 см.  Пробы в воздушно-сухом состоянии были просеяны через сито, с размером ячейки 1 мм и использованы в последующих минералогическом и микробиологическом анализах. Анализ гранулометрического и минерального состава отобранных горных пород проводился на кафедре инженерной и экологической геологии геологического факультета, микробиологические − на кафедре микробиологии почв факультета почвоведения и микробилогии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

По гранулометрическому составу отобранные породы по данным ситового анализа, выполненного по ГОСТ 12536-2014, согласно классификации ГОСТ 25100-2011, представлены гравелистым песком (БМ-комплекс №2) и гравийным грунтом с песчаным заполнителем (БМ-комплекс №1), элювиально-делювиального происхождения (таблица 1).

Таблица 1 — Характеристика образцов и координаты отбора проб

 

Минеральный состав глинистой фракции определялся на дифрактометре Ultima-IV фирмы Rigaku (Япония). Рабочий режим – 40 кВ при 40 mA, медное излучение, никелевый фильтр, диапазон измерений – 3–55° и 3–65° 2θ, шаг по углу сканирования – 0.02° 2θ, фиксированная система фокусировочных щелей. Для ускорения съемки и повышения качества экспериментальных данных использовался полупроводниковый детектор DTex/Ultra: скорость сканирования – 10° 2θ/минуту.

Оценка численности и разнообразия комплекса актиномицетов производилась методом посева водных суспензий образцов на плотную питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза — 10, аспарагин — 0,5, K₂HPO₄ — 0,5, агар — 20. Для ограничения роста мицелиальных грибов в агар был добавлен нистатин (250 мкг/мл). Чашки Петри с посевом инкубировались при 28°С в течение недели, после чего подсчитывались выросшие колонии и выделялись клоны для дальнейшей работы. Выделенные культуры хранились в пробирках со скошенной овсяной средой при температуре +4°C.

Первоначальное дифференцирование культур осуществляли на основе изучения морфологических признаков колоний в оптическом микроскопе (Fisherbrand™AX-500, Fisher Scientific). В дальнейшем, проводили филогенетическое исследование выделенных штаммов на основе анализа фрагментов 16S рРНК по раннее описанной схеме [15], и сопоставляли их с аналогичными фрагментами из базы данных GenBank.

Среди всех выделенных культур был выполнен скрининг на наличие антибиотической активности in vitro методом лунок в отношении тест-культур бактерий: Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus cereus ATCC 10702, Escherichia coli ATCC 25923.

Результаты и обсуждение

Минеральный состав – фракции более 1 мм

В соответствии со степенью геологической изученности данной территории, гора Алоус сложена палеозойскими гранитоидами – Белореченского магматического комплекса (γPZ₂b), а также Уллукамского магматического комплекса (γPZ₃u). Породы комплексов представлены гранодиоритами крупнозернистыми, до порфировых, а также гранитами, включая огнейсованные разновидности. Жильные образования комплекса характеризуются пегматито-аплитовым составом. Граниты, включающие многочисленные ксенолиты амфиболитов, гнейсов и сланцев, слагают крупные массивы, вытянутые в направлении Кавказского хребта. В петрохимическом отношении все породы Белореченского и Уллукамского комплекса относятся к нормальному ряду гранодиоритов и лейкогранитов. Обломки коренных пород на природных биоминеральных комплексах с горы Алоус, исследованные нами ранее [16] в шлифах были определены как граниты полнокристаллические с неравномерной средне-крупнозернистой структурой и такситовой текстурой (встречаются вытянутые зоны, сложенные исключительно кварцем). Главные породообразующие минералы: плагиоклаз (50%), кварц (35%), калиевый полевой шпат (10%) и биотит (5%). Акцессорный минерал – циркон (1%). Вторичные минералы серицит и глинистые развиваются преимущественно по плагиоклазам.

Таким образом, минеральный состав отобранных проб пород, для фракций более 1 мм представлен, в основном, зернами плагиоклаза и кварца гравийной размерности.

Минеральный состав – фракции менее 1 мм

Для всех отобранных образцов характерно преобладание глинистых минералов (иллит с примесью смектита и каолинита), их содержание колеблется от 35 до 46%. В исследованных породах довольно много также обломков кристаллов кварца (от 14 до 25 %), в оставшейся части они состоят из полевых шпатов и хлоритов (таблица 2). Диаграммы распределения минерального состава исследованных образцов представлены на рисунке 4.

 

Таблица 2 – Результаты количественного рентгенодифракционного анализа потребляемых пород на БМ-комплексах горы Алоус (%)

Примечание: * – результаты рентгенодифракционного анализа образцов, не потребляемых животными горных пород (фоновые), отобранных с вершины горы Алоус

** – CCM – смешанно-слойные минералы

 

Рис. 4 – Минеральный состав исследованных образцов

 

Применение в качестве метода пробоподготовки сухого просеивания через сито с диаметром отверстий 1 мм с последующим посевом водных суспензий образцов полученных фракций больше и меньше 1 мм на плотную питательную среду — позволило обнаружить приуроченность прокариотных организмов к более мелкой фракции.

Как известно, в коре выветривания горных пород микроорганизмы находятся в адсорбированном состоянии, благодаря действию различных физико-химических сил, а также молекулярно-биологических механизмов. Кроме того, на взаимодействие клеток с различными минеральными частицами существенно влияют: химический состав минерала (в том числе, электрический заряд поверхности), наличие органических пленок на его поверхности, концентрация катионов в среде, влажность и другие. Но прежде всего, количество адгезированных клеток прямо пропорционально величине поверхности, на которую они могут прикрепиться, поэтому адгезия при расчете на единицу веса сорбента – обратно пропорциональна размеру частиц [17].

Возможно этим и объясняется, что микробиологический посев фракции, оставшейся на сите с диаметром 1 мм и представленной, в основном, обломками плагиоклазов и кварца, показал крайне низкую численность микроорганизмов на питательной среде. Разница в численности выявленных прокариот при посеве водных суспензий из двух размерных фракций составила более чем два порядка (рис. 5).

Рис. 5 – Общая численность прокариот (N), выявляемая при посеве двух размерных фракций из образцов БМ-комплексов №1 и №2

 

Посев суспензий из фракций менее 1 мм обнаружил сравнительно высокую численность актинобактерий, сопоставимую с численностью актиномицетов в гумусовом горизонте черноземов [18]. Численность мицелиальных прокариот в слое 0-3 см составила для обоих БМ-комплексов млн. КОЕ/г (рис. 6). Однако, довольно низкое разнообразие выявленных морфотипов актинобактерий (таблица 3), напротив, скорее характерно для малогумусных («бедных») почв с низким содержанием органики.

Подавляющее большинство актиномицетов, выделенных методом посева из образцов, потребляемых животными горных пород, отобранных в пределах изучаемых ПБК, принадлежат к роду Streptomyces, что является характерной чертой для большинства почв. Представителя рода Micromonospora, как правило, связаны с растениями или растительными остатками, поэтому в минеральных почвенных горизонтах являются минорными компонентами комплекса (таблица 3).

 

Таблица 3 – Мицелиальные актинобактерии, выделенные из образцов, исследуемых БМ-комплексов

№	Штамм	Номер БМ-комплекса и глубина отбора	Идентифицирован как	Доля в прокариотном комплексе, %
1	GA1	БМ-комплекс №1, 0-3 см	Streptomyces sp.	6
2	GA2		Streptomyces sp.	6
3	GA4		Streptomyces sp.	6
4	GA5	БМ-комплекс №1, 10-15 см	Streptomyces sp.	9
5	GA6		Streptomyces sp.	9
6	GA7		Streptomyces	9
7	GA8		Micromonospora sp.	9
8	GA9	БМ-комплекс №2, 0-3 см	Streptomyces sp.	3
9	GA10		Streptomyces sp.	3
10	GA15	БМ-комплекс №2, 10-15 см	Streptomyces sp.	6
11	GA19		Streptomyces sp.	6

 

Рис. 6 – Численность одноклеточных и мицелиальных прокариот в исследованных образцах: БМ-комплекс №1 (а), БМ-комплекс №2 (б)

 

Скрининг антагонистической активности среди всех выделенных штаммов актиномицетов позволил обнаружить стрептомицеты, вызывающие подавление роста тест-организмов: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli (таблица 4). Данные виды бактерий широко известны не только благодаря широкому распространению в природе, но и, как патогены человека и животных, вызывающие целый спектр заболеваний от токсикоинфекций до септицемий (СП 1.3.2322-08). Антагонизм в отношении грамположительных организмов (S. aureus, B. cereus) встречается среди актиномицетов намного чаще, чем способность противостоять росту грамотрицательных бактерий, в частности E. coli (таблица 4). Это связано, во-первых, собственно с особенностями строения клеточной стенки грамотрицательных бактерий, препятствующей проникновению внутрь клетки крупных биомолекул, а с другой, со способностью удалять из клеток мелкие чужеродные молекулы благодаря механизму активного транспорта. Таким образом, штаммы актиномицетов, способные вырабатывать вещества, ограничивающие рост грамотрицательных бактерий, обладают значительными перспективами для дальнейшего исследования и использования их свойств.

С этой точки зрения наиболее перспективным для дальнейшего изучения является штамм Streptomyces sp. GA5, проявивший себя не только как активный антагонист в отношении S. aureus, но и способный препятствовать росту E. coli (рис. 7).

Филогенетическое исследование наиболее антагонистически активных штаммов актинобактерий GA2, GA5 и GA7 показало, что на основании анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК данные штаммы принадлежат к видам рода Streptomyces (уровень сходства с ближайшими типовыми культурами составляет 98,99, 100 и 99,72%). Нуклеотидные последовательности этих штаммов были депонированы в базу данных GenBank с присвоением номеров MK942344, MK583685 и MK584536 соответственно (таблица 5).

Рис. 7 – Доля актиномицетов (%) в прокариотом комплексе, выделенном из образцов изучаемых БМ-комплексов: выдвинутые сектора – штаммы актиномицетов, проявившие антагонистическую активность, сектора без обозначений – одноклеточные прокариоты

 

Таблица 4 — Антагонистическая активность стрептомицетов, выделенных из исследуемых образцов

Штамм	Зона лизиса на газоне тест-организма, мм
	E.coli	S.aureus	B.cereus
GA2	2-3	10	4
GA5	5	15	⸺
GA7	⸺	12,5	13
GA9	⸺	9	⸺
GA15	⸺	7	3

 

Таблица 5 – Филогенетический анализ фрагментов генов 16S РНК актиномицетов, выделенных из образцов БМ-комплекса №1

Штамм	Референсный организм в базе данных	Уровень сходства, %	Депонирован в GenBank
GA2	Streptomyces melanogenes NBRC 12890	98,99	MK942344
GA5	Streptomyces lunaelactis MM109	100	MK583685
GA7	Streptomyces hundungensis MBRL 251T	99,72	MK584536

 

Рис. 8 – Антагонистическая активность выделенных штаммов Streptomyces spp. GA5 и GA7, определенная in vitro методом лунок в отношении тест-культур бактерий: а – Bacillus cereus, б – E.coli, в – Staphylococcus aureus

 

Распространение актиномицетов в природе связано с широким кругом экологических адаптаций, которыми они располагают: устойчивостью к низкому содержанию влаги и пониженной концентрации питательных веществ в окружающей среде, способностью к образованию покоящихся структур. Однако, являясь медленно растущими организмами, они получают возможность развиваться в почвах, представляющих собой кору выветривания горных пород, только на поздних этапах сукцессий, когда легкодоступные источники энергии уже исчерпаны. По оценкам различных исследователей, доля мицелиальных прокариот в прокариотных комплексах большинства почв редко превышает 20% от общей биомассы [18]. Однако, это не значит, что им отведена только скоромная роль «доедальщиков» органических остатков. Даже при относительно низкой численности актиномицеты способны оказывать заметное регулирующее действие на состав микробных комплексов благодаря способности продуцировать вещества с антибиотическими свойствами.

Дискуссию о том, способны ли актиномицеты синтезировать антибиотические вещества in situ, а не только в благоприятных лабораторных условиях – в настоящее время можно считать закрытой. Действительно, в литературе существует немало подтверждений тому, что антибиотики могут образовываться, накапливаться и действовать непосредственно в нестерильной почве [18]. Разумеется, конкурентная борьба происходит в тех локусах, которые оправдывают энергетические расходы на подобную «химическую войну».

Геофагия — явление, широко распространенное среди животных и которое, очевидно, оказывает благоприятное действие на их здоровье [13]. В числе причин, обуславливающих геофагию, авторы иногда предполагают антипаразитарное и антидиарейное действие потребляемых животными горных пород. Данный эффект может являться прямым следствием развития в грунте стрептомицетов, обладающих антагонистической активностью к патогенным микроорганизмам и гельминтам.

Обильное развитие стрептомицетов в выветрелом слое горных пород может быть легко детектировано животными благодаря выделению геосмина – вещества, обладающего выраженным «запахом и вкусом земли». Даже человек способен улавливать наличие данного вещества в питьевой воде, винах, фруктах и т.д при содержании его 5-50 нг/л. Для животных, особенно в засушливых биоценозах, запах геосмина может служить индикатором наличия влаги, сигналом перемены погоды.

Заключение

Таким образом, в коре выветривания горных пород на поздних этапах микробной сукцессии складываются условия для развития актиномицетов, обычно значительно уступающим в численности и биомассе другим группам микроорганизмов.

Приуроченность наибольшей численности прокариот к более мелкой фракции отобранных образцов (менее 1 мм), очевидно, тесно связана с ее минеральным составом. Как известно, глинистые минералы, преимущественно составляющие исследованную мелкую фракцию, обладают значительно более высокой адсорбционной способностью, удельной площадью поверхности и емкостью катионного обмена по сравнению с другими минералами коры выветривания.

В процессе развития актиномицеты накапливают и/или выделяют во внешнюю среду вторичные метаболиты, обладающие антагонистическими свойствами в отношении других прокариот (антибиотики). Поедание животными горных пород, с активно развивающимися в ней актиномицетами, может являться способом профилактики или лечения расстройств желудочно-кишечного тракта. Обнаружить в пределах БМ-комплексов зоны, где активно развиваются актиномицеты, животные могут, ориентируясь на запах геосмина – летучего органического вещества терпеновой природы.

Благодарности Авторы статьи выражают благодарность за помощь в отборе образцов исследуемых пород сотрудникам Кавказского государственного природного биосферного заповедника им. Х.Г. Шапошникова – Сергею Трепету и Бибиной Кристине.	Acknowledgement The authors of the article are grateful to Sergey Trepet and Bibina Kristina, the employees of the Caucasus Nature Reserve named after H.G. Shaposhnikov, for the assistance in the selection of samples of the rocks under study.
Конфликт интересов Не указан	Conflict of Interest None declared