Влияние пробиотиков на состояние защитного барьера и иммунную
систему желудочно-кишечного тракта

Д. В. Усенко, доктор медицинских наук
С. В. Николаева, кандидат медицинских наук
ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва

Вовлеченность микробиоты организма человека в нашу жизнь, ее влияние на
онтогенез c момента внутри­утробного развития до конца жизни, а также развитие
человека как биологического вида поражает и поддерживает постоянный интерес к
данной теме на протяжении последних ста лет. Основоположником науки о «полезных
микроорганизмах» является лауреат Нобелевской премии за 1908 г. И. И. Мечников,
который на заре становления иммунологии указывал на центральную роль биопленки
из сотен видов микроорганизмов, покрывающих кожу и слизистые организма, в
поддержании духовного и физического здоровья человека, его устойчивости к
воздействию неблагоприятных внешних факторов.

За прошедшее столетие в изучении микробиоты были сделаны сотни открытий,
позволивших уточнить ее роль и механизмы воздействия на организм человека,
созданы сотни лекарственных препаратов и продуктов функционального питания,
направленных на поддержание ее баланса. В настоящее время результаты анализа
генетического материала, собранного в ходе реализации международного проекта «Микробиом
человека», крупнейшими программами которого стали «Human Microbiome Project»,
реализуемый в США, и европейский проект «MetaHIT» [1], позволяют говорить о том,
что микробиота человека включает до 10 тысяч микроорганизмов [2]. Большинство из
них (88%) попадают в четыре филы (крупнейшие таксономические единицы бактерий и
архей) — Bacteroides, Firmicutes, Actinobacteria и Proteobacteria [3].
Благодаря такому разнообразию объем генетического материала микроорганизмов,
обитающих в организме человека, превышает 8 миллионов уникальных кодирующих
генов, что в 360 раз больше, чем собственно человеческих (22 тысячи).

В начале текущего года была предпринята попытка развенчать миф о 10-кратном
численном превосходстве представителей микробиоты над количеством клеток
организма человека, более 40 лет назад появившийся по результатам исследований
микробиолога Томаса Лаки (1972) [4]. Группа израильских и канадских ученых
установила, что организм «среднего человека» (с массой тела около 70 кг, в
возрасте от 20 до 30 лет и ростом 1,7 метра) состоит из 30 триллионов клеток, а
бактериальных клеток в его организме содержится 39 триллионов [5]. При этом у
другого человека может быть в два раза больше или в два раза меньше бактерий, но
наиболее вероятно, что соотношение близко к равному. Однако очевидно, что не
численность, а состав и соотношение видов микроорганизмов играют решающую роль в
системе «микробиота–хозяин».

Наиболее представительной и значимой для человека является микробиота
желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). В повседневной практике врач сталкивается с
задачей выбора эффективных и безопасных средств для коррекции ее нарушений,
уменьшения негативного воздействия проводимой терапии (в первую очередь
антибактериальными и химиопрепаратами), а также стимуляции ее защитных функций,
реализуемых как на локальном, так и системном уровне. Арсенал средств включает
пробиотики, пребиотики, синбиотики и пробиотические продукты питания с
доказанной эффективностью. Пробиотические бактерии реализуют свою
функциональность на трех уровнях организма:

• первый — микробиота ЖКТ;
• второй — эпителиальный барьер ЖКТ;
• третий — иммунная система.

Количество пробиотических штаммов, а также лекарственных препаратов
пробиотиков и пробиотических продуктов питания увеличивается год от года. Это
существенно затрудняет выбор наиболее эффективного и требует анализа большого
числа клинических и экспериментальных исследований.

В данной статье обобщены результаты экспериментальных исследований влияния
пробиотического штамма L. casei DN-114001 (L. paracasei
CNCMI-1518) на состав и метаболическую активность микробиоты, слизистый кишечный
барьер и иммунную систему ЖКТ, а также клинических исследований профилактической
эффективности пробиотического кисломолочного продукта (ПКП) Actimel, содержащего
данный штамм в концентрации 1 × 10⁸ КОЕ/мл.

Влияние Lactobacillus сasei DN-114001 на микробиоту
желудочно-кишечного тракта

Воздействие пробиотиков на микробиоту ЖКТ многопланово. Наиболее изучены
механизмы антагонистического влияния на факультативную микробиоту за счет
снижения внутрипросветной pH, синтеза бактериоцинов и лантабиотиков, продукты
микробного метаболизма (молочная кислота и короткоцепочечные жирные кислоты,
перекись водорода, сероводород), конкуренции за пищевые субстраты и факторы
роста, а также блокирование мест прикрепления и инвазии в слизистую оболочку.

Одним из наиболее ожидаемых результатов пробиотической терапии наряду с
подавлением активности факультативной микробиоты является повышение количества
фекальных лакто- и бифидобактерий, а также нормализация метаболической
активности микробиоты ЖКТ.

В одном из первых исследований по оценке влияния пробиотического штамма
L. сasei DN-114001 на микробиоту ЖКТ гнотобионтных крыс был отмечен рост
популяции бифидобактерий, а также модулирована активность метаболических и
энзиматических параметров [6]. Концентрации короткоцепочечных жирных кислот
(уксусной, пропионовой и масляной) были значимо выше в группе животных,
получавших ПКП с L. сasei DN-114001, в сравнении с особями, получавшими
кисломолочный продукт без пробиотиков и молочное желе.

В рамках исследования Pedone исследована динамика содержания лактобактерий в
фекалиях здоровых детей в возрасте 10–18 месяцев, получавших в течение 30 дней
один из трех продуктов: молоко, ферментированное L. bulgaricus и S.
thermophilus, ПКП, содержащий L. сasei DN-114001, молочное желе
[7]. Распределение детей проходило случайным образом, после 1-недельного
вводного периода. Образцы кала собирали во время ввод­ного периода (D-8, D0),
через 2 недели и 1 месяц приема продуктов (D15, D30) и в конце наблюдения (D38).
Как показали результаты исследования, в группе, употреблявшей ПКП, содержащий
L. сasei DN-114001, количество детей, имеющих популяцию
Lactobacillus в концентрации выше 6log10 КОЕ/г, достоверно увеличилось с
18% до 68% (р < 0,05) в сравнении c другими группами. В этой же группе выявлено снижение активности β-глюкуронидазы и β-гликозидазы (р < 0,05), особенно у тех детей, у которых активность этих ферментов была первоначально высокой, что демонстрирует положительное влияние ПКП с L. casei DN-114001 на
метаболическую активность кишечной флоры. Таким образом, представленные
результаты показывают, что ПКП с L. casei DN-114001 может
способствовать восстановлению баланса и метаболической активности кишечной
микробиоты.

Влияние Lactobacillus сasei DN-114001 на слизистую оболочку
кишечника

Защитный муциновый слой покрывает эпителий ЖКТ. Этот слой функционирует как
активный барьер, который синтезируется и секретируется бокаловидными клетками
[8]. Достоверное увеличение числа бокаловидных клеток кишечника происходит в
результате включения в рацион питания животных (мышей) ПКП, содержащего L.
casei DN-114001 [9].

Первыми с пробиотиками в кишечнике взаимодействуют эпителиальные клетки
кишечника (ЭКК). Повышение адгезивных свойств пробиотических бактерий может
усилить их выживаемость в ЖКТ, обеспечивая лучшую активацию эпителиальных клеток
кишечника [10].

Контакт пробиотических микроорганизмов с ЭКК является первым этапом,
необходимым для трансдукции сигналов, которые стимулируют иммунный ответ в
кишечнике, что было продемонстрировано для L. casei DN-114001 [9, 11].
В исследовании на мышах, получивших перорально суспензию L. casei
DN-114001 (10⁹ КОЕ/мл), уже через 10 минут было отмечено
взаимодействие данного пробиотического микроорганизма с микроворсинками
энтероцитов, что проводило к активации ЭКК в виде увеличения числа
мультивезикулярных телец в их цитоплазме [9].

Важную роль во взаимодействии пробиотических микроорганизмов с ЭКК играют
toll-подобные рецепторы (TLR), стимуляция которых вызывает продукцию клетками
ИЛ-6, ИЛ-1 и ИЛ-8 [12]. В исследовании C. M. Galdeano с соавт. (2009) степень
активации ЭКК у мышей, получавших ПКП, содержащий L. casei DN-114001, оценивали
путем измерения высвобождения ИЛ-6 из энтероцитов [9]. Было установлено
существенное повышение продукции ИЛ-6, однако его уровень был ниже, чем в ответ
на воздействие патогенных бактерий [13]. Данный цитокин инициирует и
поддерживает взаимодействие ЭКК и иммунных клеток кишечника, а также участвует в
индукции образования IgA в ходе клональной селекции B-клеток [14].

Непосредственное взаимодействие пробиотических микроорганизмов с ЭКК способно
повышать их устойчивость к воздействию патогенных бактерий и вирусов. В
исследовании M. Freitas с соавт. (2003) на модели эпителиальных клеток линии
НТ29-ТХ была изучена способность L. casei DN-114001 препятствовать
адгезии ротавируса [15]. Было показано, что инкубирование клеток кишечного
эпителия линии НТ29-ТХ в среде, содержащей 20% надосадочной жидкости, взятой от
культуры L. casei DN-114001, усиливало связывание β-галактозы со
специфическими лектинами более чем на 60%, а также уменьшало инфицирование
клеток ротавирусом на 70%.

В другом исследовании эпителиальные клетки кишечника человека линии Т84,
инфицированные энтеропатогенной E. coli (ЕРЕС), инкубировали в
присутствии L. casei DN-114001 в двух режимах: совместное инкубирование
(патогенный и пробиотический штаммы одновременно инкубировали с клетками Т84) и
постинфекционное (пробиотик добавляли через 3 ч после инфицирования патогенными
бактериями) [16]. В обоих случаях совместное инкубирование в присутствии L.
casei DN-114001 препятствовало снижению трансэпителиальной резистентности,
вызванному E. coli, и одновременно ингибировало увеличение
индуцированной энтеропатогенными кишечными палочками парацеллюлярной
проницаемости.

Влияние Lactobacillus сasei DN-114001 на иммунную систему
желудочно-кишечного тракта

Пробиотические бактерии или фрагменты их бактериальных стенок успешно
взаимодействуют с многочисленными клетками иммунной системы кишечника. Однако
иммунотропность пробиотических штаммов имеет существенные различия. Так,
пробиотический штамм L. casei CRL-431 вызывал увеличение количество
клеток продуцентов IgA, дендритных клеток и макрофагов, но не оказывал значимого
влияния на количество CD4⁺ или CD8⁺ Т-лимфоцитов в тонкой
кишке [17]. Для штамма L. casei DN-114001, напротив, была
продемонстрирована способность стимулировать не только активность IgA⁺
клеток, но также вызывать увеличение числа CD8⁺ и CD4⁺
лимфоцитов в биоптатах тонкой кишки [18].

Большое значение имеет изучение механизмов взаимодействия пробиотиков с
системой врожденного иммунитета как первой универсальной линией иммунологической
защиты организма. По данным C. M. Galdeano и G. Perdigon (2006), пробиотические
бактерии вызывают активацию макрофагов и дендритных клеток [19, 20]. Говоря о
влиянии пробиотических продуктов на систему врожденного иммунитета, можно
привести данные исследования C. M. Galdeano с соавт. (2009), показавшего, что
включение в рацион мышей ПКП с L. casei DN-114001 вызывало увеличение
количества макрофагов в lamina propria по сравнению с животными без особого
кормления, однако не влияло на количество дендритных клеток. При этом изменения
количества макрофагов не были связаны с экспрессией клеточных рецепторов CD 206
и TLR-4 [9].

Пробиотические лактобактерии демонстрируют существенные отличия в способности
индуцировать выделение дендритными клетками про- и противовоспалительных
цитокинов. В работе H. R. Cristensen с соавт. (2002) была продемонстрирована
способность L. casei стимулировать продукцию ИЛ-6, ИЛ-12 и фактора
некроза опухоли α (ФНО-α), а также экспрессию маркеров созревания ДК, тогда как
штамм Lactobacillus reuteri характеризовался слабой
цитокин-индуцирующей активностью и подавлял секрецию цитокинов и экспрессию
маркеров созревания [21]. Полученные результаты позволяют предположить, что
разные виды/штаммы лактобактерий могут оказывать различное влияние на
функционирование дендритных клеток и таким образом осуществлять регуляцию
первоначальных этапов иммунного ответа.

Учитывая тот факт, что ПКП являются элементом ежедневного рациона человека,
эффекты их долговременного применения также требуют экспериментальной оценки. В
исследовании, выполненном C. M. Galdeano и G. Perdigon (2004), включение ПКП,
обогащенного L. casei DN-114001, в рацион мышей на длительный период
(98 дней) сопровождалось увеличением концентрации ФНО-α и интерферона γ (ИФН-γ),
секретируемых активированными Т-клетками, NK, макрофагами и ДК собственной
пластинки кишечника [11].

Профилактическая эффективность кисломолочного продукта, обогащенного
Lactobacillus сasei DN-114001

Инфекции ЖКТ традиционно являются объектом для оценки профилактической
эффективности пробиотиков и ПКП. В многоцентровом исследования, проведенном C.
A. Pedone с соавт. в 2000 году во Франции, принимали участие 928 детей в
возрасте от 6 до 24 месяцев, из которых 463 получали пробиотический продукт,
содержащий L. casei DN-114001, а 465 — в качестве плацебо —
традиционный йогурт [7]. В течение 12-недельного периода употребления изучаемых
продуктов число детей, перенесших острые кишечные инфекции (ОКИ), было
значительно ниже в группе, получавшей пробиотический продукт (15,9%), чем в
группе, получавшей йогурт (22%) (р = 0,029). Кроме этого, после 12 недель
исследования количество детей, у которых обнаруживали антиген ротавируса в кале,
уменьшилось с 5,21% до 0,29% в 1-й группе, что достоверно более значимо, чем во
2-й группе — с 4,81% до 2,2%.

Второй по частоте применения пробиотиков является проблема профилактики
антибиотико-ассоциированной диареи (ААД), в том числе Clostridium difficile-ассоциированной
диареи. Кисло­молочный продукт, содержащий L. casei DN-114001, продемонстрировал
высокую эффективность в профилактике ААД [22]. В ходе рандомизированного
плацебо-контролируемого исследования было установлено, что на фоне системной
антибактериальной терапии ААД возникла у 7 (12%) из 57 больных, получавших
пробиотический продукт, по сравнению с 19 (34%) из 56 больных в группе плацебо (р
= 0,007). Абсолютное снижение риска составило 21,6% (с доверительным интервалом
(ДИ) от 6,6% до 36,6%), а необходимое число пролеченных больных для получения
одного благоприятного или предупреждения одного неблагоприятного исхода (NTT)
оказалось равно 5 (ДИ от 3 до 15). В основной группе участников не было выявлено
ни одного случая C. difficile-диареи. Напротив, в группе плацебо такая
диарея имела место у 9 из 53 больных (17%) (p = 0,001). Абсолютное снижение
риска C. difficile-диареи составило 17% (ДИ от 7% до 27%).

Большее число исследований посвящено оценке пробиотиков и пробиотических
продуктов в профилактических и терапевтических программах при острых
респираторных инфекциях у детей и взрослых. Оценка эффективности кисломолочного
продукта, содержащего пробиотический штамм L. casei DN-114001,
проводилась в исследовании DRINK [23]. В двойном слепом рандомизированном
плацебо-контролируемом клиническом исследовании с сокрытием принадлежности
субъектов к группе в округе Вашингтон (США) приняли участие 638 детей в возрасте
3–6 лет, посещающих детские сады или школы. Участники на протяжении 90 дней
употребляли пробиотический продукт (основная группа) или продукт-плацебо без
живой культуры. Установлено, что частота распространенных инфекционных
заболеваний (острые респираторные заболевания + ОКИ) в основной группе (0,0782
случаев на 100 человеко-дней) была на 19% ниже, чем в группе плацебо (0,0986
случаев на 100 человеко-дней) (показатель заболеваемости — 0,81, 95% ДИ: 0,65;
099) (p = 0,046). Частота инфекций верхних дыхательных путей в основной группе
(0,027 случая на 100 человеко-дней) была на 18% ниже, чем в группе плацебо
(0,033 случая на 100 человеко-дней) (показатель частоты — 0,82, 95% ДИ: 0,68,
0,99, р = 0,036).

Заключение

Резюмируя представленные в статье данные, можно отметить, что за последние
годы наши знания о микробиоте человека, механизмах действия пробиотиков
значительно расширились, а содержащие их препараты и продукты питания прочно
вошли в повседневную жизнь. Их адекватное использование может способствовать
оптимизации состава кишечной микробиоты, что является важным и необходимым
инструментом профилактики различных заболеваний и сохранения здоровья человека.

Литература

1. Электронный ресурс: http://www.genomeweb.com/node/1089736? hq_e=el&hq_m=1293079&hq_l=1&hq_v=8701270008.
2. Pflughoeft K. J., Versalovic J. Human Microbiome in Health and
   Disease // Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 2012; 7: 99–122.
3. Arumugam M. Enterotypes of the human gut microbiome // Nature. 2011; 473
   (7346): 174–180.
4. Luckey T. Introduction to intestinal microecology // Am. J. Clin.
   Nutr. 1972; 25, 1292–1294.
5. Sender R., Fuchs S., Milo R. Revised estimates for the number of
   human and bacteria cells in the body. bioRxiv preprint first posted online Jan.
   6, 2016; doi: http://dx.doi.org/10.1101/036103.
6. Djouzi Z. The association of yogurts starters with Lactobacillus
   casei DN 114–001 in fermented milk alters the composition and metabolism of
   intestinal microflora in germ-free rats and in human flora-associated rats //
   Journal of Nutrition. 1997, 127: 2260–2266.
7. Pedone C. A., Arnaud C. C, Postaire E. R., Bouley C. F., Reinert P.
   Multicentric study of the effect of milk fermented by Lactobacillus casei on
   the incidence of diarrhea // Int. J. Clin. Prac. 2000; 54 (9): 568–571.
8. Mack D. R., Michail S., Wei S., McDougall L., Hollingsworth M. A.
   Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing
   intestinal mucin gene expression // Am. J. Physiol. 1999, 276, G941-G950.
9. Galdeano C. M., de Moreno de LeBlanc A., Carmuega E., Weill R.,
   Perdigon G. Mechanisms involved in the immunostimulation by probiotic
   fermented milk // J. Dairy Res. 2009, 76, 446–454.
10. Bezkorovainy A. Probiotics: Determinants of survival and growth
    in the gut // Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73, 399 S-405 S.
11. Galdeano C. M., Perdigon G. Role of viability of probiotic
    strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation //
    J. Appl. Microbiol. 2004, 97, 673–681.
12. Haller D., Bode C., Hammes W. P., Pfeifer A. M., Schiffrin E. J., Blum
    S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by
    intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures // Gut. 2000, 47, 79–87.
13. Vinderola G., Matar C., Perdigon G. Role of intestinal epithelial
    cells in immune effects mediated by gram-positive probiotic bacteria:
    Involvement of Toll-like receptors // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12,
    1075–1084.
14. Beagley K. W., Eldridge J. H., Aicher W. K., Mestecky J., Di Fabio S.,
    Kiyono H., McGhee J. R. Peyer’s patch b cells with memory cell
    characteristics undergo terminal differentiation within 24 hours in response
    to interleukin-6 // Cytokine. 1991, 3, 107–116.
15. Freitas M., Tavan E., Thoreux К. et al. Lactobacillus casei DN
    114–001 and Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 inhibit rotavirus infection
    by modulating apical glycosylation pattern of cultured human intestinal
    HT29-TX cells // Gastroenterol. 2004, 124 (Suppl 1): A475-A476.
16. Parassol N., Freitas M., Thoreux K. et al. Lactobacillus casei DN
    114–001 inhibits the increase in paracel-lular permeability of
    enteropathogenic Escherichia coli-infected T84 cells // Res Microbiol. 2005,
    156 (2): 256–262.
17. Galdeano C. M., de Moreno de LeBlanc A., Vinderola G., Bonet M. E.,
    Perdigon G. Proposed model: Mechanisms of immunomodulation induced by
    probiotic bacteria // Clin. Vaccine. Immunol. 2007, 14, 485–492.
18. De Moreno de Leblanc A., Chaves S., Carmuega E., Weill R., Antoine J.,
    Perdigon G. Effect of long-term continuous consumption of fermented milk
    containing probiotic bacteria on mucosal immunity and the activity of
    peritoneal macrophages // Immunobiology. 2008, 213, 97–108.
19. Galdeano C. M., Perdigon G. The probiotic bacterium lactobacillus
    casei induces activation of the gut mucosal immune system through innate
    immunity // Clin. Vaccine Immunol. 2006, 13, 219–226.
20. Wen H., Schaller M. A., Dou Y., Hogaboam C. M., Kunkel S. L.
    Dendritic cells at the interface of innate and acquired immunity: The role for
    epigenetic changes // J. Leukoc. Biol. 2008, 83, 439–446.
21. Cristensen H. R., Frokiaer H., Pestka J. J. Lactobacilli
    differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers
    in murine dendritic cells // J. Immunol. 2002; 168: p. 171–178.
22. Hickson M., D’Souza A., Muthu N. et al. Use of probiotic
    Lactobacillus preparation to prevent diarrhoea associated with antibiotics:
    randomised double blind placebo controlled trial // BMJ. 2007; 335: 80–85.
23. Merenstein D., Murphy M., Fokar A. et al. Use of a fermented
    dairy probiotic drink containing Lactobacillus casei (DN-114 001) to decrease
    the rate of illness in kids: the DRINK study A patient-oriented, double-blind,
    cluster-randomized, placebo-controlled, clinical trial // Eur J Clin Nutr.
    2010 July; 64 (7): 669–677.

Статья опубликована в журнале

Лечащий Врач