Патогенные микроорганизмы: проблемы диагностики и биобезопасности на современном этапе | Птицина С.Н., Царева А.Ю.

Введение

Революция в развитии методов биотехнологии, новые достижения в генетике, медицине и технологическом преобразовании окружающей среды вызвали также вполне ожидаемые опасения в появлении проблем, связанных с биобезопасностью [1]. Одним из типов угроз как для человека, так и для окружающей среды могут стать генетически измененные патогенные микроорганизмы, обладающие множественной лекарственной устойчивостью и способные развиваться в экстремальных условиях. Особую опасность представляют неуправляемые патогены, включающие гибридные микроорганизмы, созданные с добавлением в геном фагов и плазмид, а также целевых фрагментов чужеродного генома других организмов. В последние годы отмечается прогресс космической микробиологии, изучающей патогенные грибы и бактерии, которые способны существовать в условиях космической радиации, устойчивы к магнитным и электромагнитным излучениям, акустическим полям малой мощности и могут быть использованы в биотеррористических атаках.

По рекомендации Организации объединенных наций в 1972 г. была разработана Конвенция о запрещении разработки, производства и накопления запасов бактериологического (биологического) и токсинного оружия и об их уничтожении (КБТО)¹. На настоящий момент ее участниками являются 187 государств. В сферу действия КБТО входят микробиологические и другие биологические агенты или токсины, независимо от происхождения или метода их производства, которые не предназначены для профилактических, защитных или других мирных целей, а также оборудование или средства доставки, предназначенные для использования таких агентов или токсинов во враждебных целях или в вооруженных конфликтах. Однако отсутствие механизма контроля ограничивало ранее и до сих пор затрудняет выполнение положений Конвенции, поэтому проблема биобезопасности населения и биотерроризма продолжает оставаться актуальной.

Характеристики патогенных микроорганизмов и их токсинов

Основу биологического оружия составляют патогенные биологические агенты (ПБА). К ПБА относятся вирусы, бактерии, риккетсии, грибы, токсины, которые в начале XXI века были разделены на 3 категории: А, В и С — в зависимости от степени нанесения вреда человеку [2, 3]. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала национальным комитетам эпидемио­логического надзора составить ранжированный список ПБА, актуальный для внутреннего пользования². При классификации учитывались такие показатели, как заболеваемость, смертность, контагиозность, величина инфекционной дозы, путь передачи (через переносчиков, от человека человеку, через продукты питания и источники воды), а также наличие/отсутствие диа­гностических тестов, средств профилактики. В нашем обзоре, посвященном патогенным микроорганизмам бактериальной природы, мы использовали именно эту классификацию.

Согласно ей, микроорганизмы категории В менее опасны, чем агенты, относящиеся к категории А. Но способность быстро распространяться на значительных территориях, экологическая устойчивость и возможность аэрозольного применения определяют их потенциал в качестве агента при биотерроризме.

Возбудитель сибирской язвы

К микроорганизмам категории А относится возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis — патогенный микроорганизм, очень стабильный в аэрозольной форме, что делает его одним из предпочтительных вариантов биологического оружия [4].

Это аэробная или факультативно-анаэробная, инкапсулированная, грамположительная спорообразующая бацилла, хорошо растущая на кровяном агаре в виде крупных колоний неправильной формы. Название «антракс» происходит от греческого слова «anthrax», что означает «уголь» и характеризует цвет некротических поражений, которые встречаются при кожной форме сибирской язвы. Споры B. anthracis являются крайне устойчивыми к воздействию внешних факторов, способны на протяжении сотни лет сохранять свои патогенные свойства, не имеют запаха и вкуса. Для производства содержащего их биологического оружия часто используют оборудование, предназначенное для изготовления вакцин. B. anthracis способны проникать в организм человека с воздухом при дыхании или через небольшие раны на коже, вызывая кожную или легочную форму заболевания. Легочная форма сибирской язвы приводит к сепсису и полиорганной недостаточности. Смертность при данной форме заболевания составляет 95%. Сухую доставку спор сибирской язвы можно легко осуществить, помещая их, например, в почтовую корреспонденцию, как произошло в Соединенных Штатах в 2001 г. [4].

Возбудитель чумы

Чума, заболевание, оставившее свой след в истории как «черная смерть», остается серьезной угрозой для человечества и сегодня. Возбудителем чумы является грамотрицательная, не образующая спор коккобацилла Yersinia pestis. Микроорганизм представляет собой клон, произошедший от кишечного патогена Yersinia pseudotuberculosis (около 97% сходства на уровне хромосомной ДНК). Y. pestis содержит плазмиду pCD1 (70–75 т. п.н.). В ходе эволюции вид Y. pestis приобрел две дополнительные плазмиды и уникальный хромосомный остров высокой патогенности, состоящий из 32 генов. Некоторые детерминанты, кодируемые плазмидами, pMT1 и pPCP1, способствуют спе­ци­фической для Y. pestis инвазии тканей, выживанию в переносчиках — блохах или интенсивному росту в крови хозяина. Y. pestis в естественных условиях в природных очагах чумы циркулирует только в узком диапазоне хозяев: между резервуарными хозяевами — грызунами и переносчиками — блохами. Физиология и патогенез Y. pestis на транскрипционном и посттранскрипционном уровне до сих пор недостаточно изучены. Выживание внутри макрофагальных вакуолей теплокровных хозяев считается критически важным на ранних стадиях жизненного цикла Y. pestis. Известно, что штамм Y. pestis, выделенный от блох, проявляет устойчивость к фагоцитозу. Внутриклеточная микросреда макрофагов может обеспечить временное убежище для патогена и вызвать синтез факторов антифагоцитоза для последующего высвобождения во внеклеточную среду. Двухкомпонентная регуляторная система PhoP/PhoQ помогает выживанию Y. pestis в макрофагах посредством плейотропного воздействия на экспрессию генов [5, 6]. Возбудитель чумы Y. pestis использует различные механизмы захвата железа в организме хозяина. Y. pestis использует сидерофор, поглощающий железо, йерсиниабактин (Ybt) и транспортеры железа (Yfe и Feo) для преодоления недостатка железа. Два транспортера железа, которые функционируют в Y. pestis, играют важную роль в прогрессировании бубонной чумы [7]. Секвенирование ДНК показало, что Y. pestis приобрела патогенность для людей на самых ранних стадиях своей эволюции [8]. Новые противочумные вакцины находятся на стадии разработки, а существующие пока не имеют доказательной эффективности. Поэтому получение вакцинных препаратов является особенно актуальным.

Возбудитель чумы относится к категории А биологического оружия. Эпидемио­логия чумы в случае биотеррористической атаки будет существенно отличаться от естественных инфекций. При аэрозольном распылении симптомы изначально могут напоминать острые респираторные инфекции неясной этиологии. Уровень смертности во многом может зависеть от используемого штамма. Вспышка чумы в районах, где ранее не сообщалось о наличии зоонозных инфекций, в сочетании с отсутствием большого количества мертвых крыс может указывать на преднамеренную биотеррористическую атаку [9].

Возбудитель туляремии

Еще одним потенциально опасным агентом категории А может быть возбудитель туляремии. Туляремия, вызываемая грамотрицательной бактерией Francisella tularensis, является высокоинфекционным зоонозным заболеванием. Случаи заболевания у людей были зарегистрированы в основном в Соединенных Штатах Америки, странах Северной Европы, таких как Швеция и Финляндия, а также в некоторых европейских и азиатских странах. Низкая инфекционная доза, высокая летальность, аэрозольный путь передачи делают F. tularensis потенциально опасным микроорганизмом. Мелкие млекопитающие, такие как кролики, зайцы и ондатры, являются основными источниками инфекции, но истинный резервуар F. tularensis нуждается в уточнении. Необходимо получение дополнительной информации о диких и домашних животных, которые могут выступать в качестве резервуаров F. tularensis. С точки зрения общественного здравоохранения надзор за заболеваемостью животных туляремией имеет решающее значение для предотвращения и мониторинга вспышек среди людей, особенно в эндемичных районах. Люди могут заразиться туляремией через укусы разных переносчиков, при контакте с водой или с зараженными животными, а также при употреблении их мяса в пищу. Трансмиссия штамма в основном связана с клещами и комарами. Подвиды бактерий и способ передачи определяют клиническую картину. Многие аспекты биологии и эпидемио­логии F. tularensis требуют дальнейшего изучения, в частности ее патогенность и вирулентность, спе­ци­фические механизмы, с помощью которых F. tularensis уклоняется, модулирует и подавляет иммунный ответ хозяина [10].

Биологические агенты категории В

В список категории В включены потенциально опасные биологические агенты. Данные микроорганизмы менее опасны, чем агенты, относящиеся к категории А, но способность быстро распространяться на значительных территориях, минимально требуемая инфекционная доза, экологическая устойчивость и возможность аэрозольного использования делают их потенциально применимыми при биотерроризме. К ним относятся: Coxiella burnetii, вызывающая лихорадку Ку; Rickettsia prowazekii — сыпной тиф; Rickettsia rickettsii — пятнистую лихорадку Скалистых гор; Chlamydia psittaci — орнитоз.

Патогенные грибы, вызывающие такие заболевания, как гистоплазмоз (Histoplasma capsulatum) и кокцидио­идомикоз (Coccidioides immitis), также отнесены к потенциально возможным биологическим агентам при террористической атаке [11].

Диагностика патогенных микроорганизмов и проблемы безопасности

Основными методами диа­гностики чумы являются: полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод иммунофлуо-ресценции и иммуноферментный анализ. Разработаны новые методы детекции патогенов на основе геномных и транскриптомных инструментов анализа. Успешно применяется новый, достаточно дешевый и простой в использовании метод диа­гностики — нанопоровая платформа секвенирования генома третьего поколения NanoPore [12]. Однако необходимость разработки способов быстрого и точного определения диких и генетически модифицированных штаммов остается актуальной задачей.

Система CRISPR/Cas9 уже продемонстрировала свои возможности удивительным разнообразием вариантов ее применения, связанных с редактированием генома и генной инженерией. Один из наиболее актуальных видов ее использования в настоящее время — диа­гностика инфекционных и неинфекционных заболеваний. Вирусные, бактериальные и неинфекционные заболевания, такие как рак, могут быть диа­гностированы с помощью биотехнологии CRISPR/Cas. Разработаны диа­гностические тесты с использованием ферментов Cas12 и Cas13 для обнаружения вируса SARS-CoV-2. Классификация систем CRISPR/Cas, а также основы механизмов действия CRISPR/Cas подробно представлены в литературе [13].

Технология секвенирования с длинными считываниями позволяет идентифицировать разнообразие транскриптомов и анализировать значительные структурные вариации в геномах патогенов. Метод оказался эффективным для идентификации известных и неизвестных патогенов растений. Преодолевая ограничения методов второго поколения, новые технологии высокопроизводительного секвенирования обеспечили более быстрое, эффективное и высокопроизводительное прочтение геномов, сборку полноразмерных транскриптов и обнаружение изменений ДНК и РНК. Кроме того, эти технологии позволили выявлять эпигенетические метки в геномах патогенов [14].

Среди новых методов диа­гностики потенциально опасных микроорганизмов следует отметить биосенсоры. Биосенсоры служат простыми, но надежными аналитическими инструментами как для полевых, так и для лабораторных исследований. Разработки новых типов биосенсоров продолжаются, и в будущем можно ожидать их применения на практике. Недавно была создана и прошла испытание новая панель для обнаружения бактерий (B. anthracis, Y. pestis, F. tularensis и Brucella spp.). Для сборки панели были выбраны и протестированы соответствующие спе­ци­фические последовательности в бактериальной ДНК, разработаны зонды MOLigo (короткие спе­ци­фические олигонуклеотиды) для снижения фонового измерения сигнала на платформе MagPix. Протестирована стабильность хранения лигационных премиксов (смесей зондов MOLigo). Испытания показали, что данный метод может использоваться для быстрого скрининга с целью предотвращения вспышек, возникающих в результате применения бактериальных штаммов в качестве биологического оружия, поскольку время анализа составляет менее 4 ч [15].

Следует сказать о появлении в 1991 г. на карте Евразии 15 независимых государств, прежде бывших республиками Советского Союза, на территории которых остались хорошо оснащенные биологические лаборатории с уникальными коллекциями микроорганизмов и высококвалифицированным персоналом. Возникла потенциальная опасность передачи информации, технической помощи, производственного оборудования, диа­гностических материалов чужим государствам, в том числе странам постсоветского пространства. Так, в 2013 г. Министерство иностранных дел Федеративной Республики Германия запустило национальную программу биобезопасности (German Biosecurity Programme), направленную на минимизацию рисков, связанных с высокопатогенными агентами, включая их потенциальное использование в террористических целях. В этом контексте в 2013 г. была создана германо-казахстанская сеть по био-безопасности и биозащите под совместным управлением Института микробиологии бундесвера и Немецкого общества по международному сотрудничеству [16].

Биологические программы под руководством Пентагона реализовывались также в лабораториях и на территории других бывших союзных республик (Грузии, Армении, Украины, Молдавии и др.). При этом США и их союзники по НАТО под предлогом борьбы с биотерроризмом держат в секрете деятельность этих биолабораторий [17].

В настоящее время происходит переориентация направления исследований с возможностью создания биологического оружия II поколения — генетически модифицированных представителей известных потенциальных агентов, которые могут преодолевать меры медицинской защиты и обладают более высокой поражающей способностью. Такие крупномасштабные проекты в США реализуются уже с 1969 г. Параллельно проводятся исследования по получению синтетических аналогов токсинов, обладающих низкой иммуногенной активностью, чтобы преодолеть защиту организма³.

С начала 1990-х годов началась разработка биологических агентов III поколения, не встречавшихся ранее в природе. Благодаря методам синтетической биологии это становится возможным [18, 19].

Одновременно возникли проблемы уязвимости компьютерных систем в лабораториях и компаниях, занимающихся созданием биобанков, таких как AncestryDNA. Полученная таким образом информация может помочь синтезировать патоген, который смертелен для небольшой группы людей с целевой генетической последовательностью, но безвреден для населения в целом [20]. Поэтому необходимо приложить больше усилий для повышения безопасности на каждом уровне, включая синтез ДНК, секвенирование ДНК, анализ секвенированных данных и защиту ценных генетических баз данных.

Синтетическая биология может быть использована для создания патогенов, которые обходят стандартные методы обнаружения. Примером может служить создание штамма Y. рestis с отсутствием белка F1, что позволило сделать традиционные методы идентификации патогена бесполезными [21]. При этом существуют риски, сопряженные с выпуском модифицированных организмов в окружающую среду. В этом случае даже использование генетических технологий и горизонтального переноса генов в открытой среде в полезных целях, например для модификации комаров — переносчиков возбудителей малярии (Plasmodium), может иметь непредсказуемые последствия [22].

Надо отметить, что именно совершенствование генно-инженерных технологий и их широкое внедрение в научную и медицинскую практику могло лежать в основе эпидемий XXI века, в том числе пандемии COVID-19 [23].

Технологии редактирования генома и синтетической биологии сегодня становятся все более доступными и в сочетании с применением искусственного интеллекта в биотехнологиях особенно мощными. Характерной чертой сегодняшнего дня является быстро меняющийся ландшафт инженерных биологических систем, который требует пересмотра и обновления мер биобезопасности. Возникла необходимость в новых методах контроля за синтезом ранее неизвестных последовательностей ДНК и секвенированием метагеномов окружающей среды для поиска синтетических организмов. Человеческая деятельность в современных масштабах привела к появлению неожиданных рисков, включающих сложность сохранения конфиденциальности персональных данных, стремительное развитие биотехнологий и искусственного интеллекта. На этапе разработки проекта редактирования генома уже сформулирован ряд принципов, касающихся ответственности и мер предосторожности [24].

Всемирная организация здравоохранения как один из международных участников представила «Руководство по лабораторной биобезопасности», в котором излагаются ключевые стандарты биобезопасности, и «Руководство по ответственному использованию наук о жизни», чтобы способствовать разработке стратегии оценки биорисков, которая может быть реализована национальными исследовательскими институтами [25].

Проблемы множественной лекарственной устойчивости

После открытия натуральных антибиотиков, спасших жизни миллионам людей и применяемых повсеместно и порой бесконтрольно, микроорганизмы, столкнувшиеся с давлением отбора противомикробных препаратов, стали быстро улучшать свою приспособленность, приобретать гены устойчивости, а затем, благодаря системе рекомбинации, распространять эти гены между видами бактерий. В процессе селекции и в результате воздействия химио­терапевтических соединений чувствительные микроорганизмы погибали, а резистентные сохранялись, размножались и распространялись в окружающей среде. Приобретенная резистентность закреплялась отбором и передавалась по наследству последующим поколениям бактерий. Стремительное развитие лекарственной устойчивости многих патогенов человека к лекарственным препаратам привело к современному кризису общественного здравоохранения, так как способность успешно лечить многочисленные инфекции сегодня находится под угрозой [26–28].

По данным ВОЗ, уже в настоящий момент супербактерии являются причиной смерти почти 700 тыс. человек в год. Например, в США ежегодно регистрируют более 2,8 млн случаев выявления антибиотикорезистентных возбудителей инфекций, в результате которых умирает более 35 тыс. человек⁴.

Многие инфекционные агенты, которые когда-то можно было успешно лечить одним из нескольких классов лекарств, приобрели устойчивость к большинству, а в некоторых случаях практически ко всем применяемым лекарственным средствам [29]. Явление резистентности возбудителей касается и противогрибковых, противопара­зитарных и противовирусных средств. Большинство классов антибиотиков, используемых для лечения бактериальных инфекций у людей, употребляются и в ветеринарии, поэтому необходим единый подход к сохранению здоровья человека, животных и окружающей среды с введением строгих ограничительных мер против неконтролируемого приема противомикробных препаратов. Особое внимание следует уделить долгосрочному использованию противомикробных препаратов в составе кормов для животных с целью стимуляции роста (таких как колистин, тетрациклины и макролиды). Везде, где употребляются противомикробные препараты, формируются резервуары устойчивости: в том числе в организме человека, в условиях больниц и сообществ; а также у животных, на фермах и в среде аквакультуры; в воде, почве, дикой природе и многих других экологических нишах.

Многие страны и несколько международных агентств применяют подход «Единое здоровье» (One Health) в своих стратегиях по борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам. Необходимые действия включают улучшение регулирования и политики использования противомикробных препаратов, надзора, руководства, контроля инфекций и санитарии [30].

В настоящее время механизмы резистентности микроорганизмов продолжают изучаться, что находит отражение как в отечественных, так и в зарубежных публикациях. В задачи исследователей входит продолжение изучения механизмов возникновения антимикробной резистентности, разработка противомикробных препаратов и альтернативных методов, технологий и средств диа­гностики и лечения инфекционных заболеваний человека, животных и растений. В последние годы создаются новые классы препаратов с принципиально иным механизмом действия. Синтезируются различные альтернативные вещества с антибактериальной активностью, а также лекарственные средства, непосредственно ингибирующие механизмы развития антибиотикорезистентности [31–34].

Для осуществления мониторинга антимикробной резистентности, помимо традиционных микробиологических и биохимических методов, сейчас применяется молекулярная диа­гностика с использованием самых передовых технологий, включая различные виды ПЦР, секвенирования следующего поколения, FISH, нанотела, иммунофлуоресцентные методы и др. Проводится оценка эффективности применения комплекса молекулярно-генетических методов: ПЦР, RAPD и MLST с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии в изучении особенностей госпитальных штаммов [35, 36].

Целью систем CRISPR являются идентификация конкретных патогенов и редактирование определенной последовательности ДНК. Один метод, получивший название FLASH, использует рекомбинацию фермента Cas9 вместе с мультиплексными направляющими РНК для точной идентификации патогена путем устранения фоновых последовательностей [37].

Проблема антимикробной резистентности вышла за рамки одной отрасли исследований и приобрела общеэкологический характер, вызывая беспокойство как среди исследователей, так и среди представителей законодательных органов во всем мире, в том числе и в России.

Разработка законодательной стратегии по биологической безопасности в РФ

В марте 2019 г. вышел указ Президента Российской Федерации «Об Основах государственной политики Российской Федерации в области обеспечения химической и биологической безопасности на период до 2025 года и дальнейшую перспективу»⁵, в котором подробно описаны основные биологические угрозы и задачи государственной политики в области обеспечения биологической безопасности, а 31 марта 2023 г. — указ «Об утверждении Концепции внешней политики Российской Федерации»⁶, где в раздел «Укрепление международного мира и безопасности» включен пункт об обеспечении биологической безопасности страны с указанием конкретных направлений.

Распоряжением Правительства Российской Федерации от 25 сентября 2017 г. № 2045-р утверждена «Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года»⁷ (далее — Стратегия). Стратегия является основой для организации деятельности и взаимодействия органов государственной власти Российской Федерации, государственных и иных организаций, принимающих участие в реализации мер, направленных на предупреждение и ограничение распространения устойчивости микроорганизмов к противомикробным препаратам.

В рамках Стратегии требуется решение проблем, связанных с рациональным применением противомикробных препаратов, в том числе средств защиты растений, а также мер по предупреждению и ограничению распространения возбудителей с антимикробной резистентностью.

Для осуществления мониторинга необходимо создание и развитие единой базы данных, содержащей информацию о распространении антимикробной резистентности, и включение ее в структуру баз данных формируемой государственной информационной системы обеспечения химической и биологической безопасности.

Заключение

В данном обзоре мы попытались с разных сторон осветить современное состояние проблемы биобезопасности, охарактеризовали отдельных возбудителей инфекций разных классов опасности, методы их диа­гностики, риски появления новых штаммов микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, а также потенциальный риск, связанный с развитием молекулярно-генетических технологий и синтетической биологии. В конце ХХ века началась эра синтетической биологии со стремительным развитием новых методов анализа и сборки геномов. ПБА нового поколения — это продукты генно-инженерных технологий, которые характеризуются низкой инфекционной дозой, нетипичным течением инфекционного процесса, отсутствием тест-систем и лекарственных средств. В настоящее время стала очевидной необходимость разработки эффективных превентивных стратегий борьбы с новыми биологическими рисками. Это нашло отражение как во все возрастающем количестве научно-исследовательских работ, заинтересованности медицинского сообщества, так и в законодательстве Российской Федерации. Чтобы решить поставленные задачи, необходимо создавать условия для развития инноваций в области естественных наук и интеллектуальных технологий.

¹Convention on the Prohibition of the Development, Production and Stockpiling of Bacteriological (Biological) and Toxin Weapons and on Their Destruction. (Electronic resource.) URL: https://treaties.unoda.org/t/bwc; (access date: 16.09.2024).

²Практическое руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях, 4-е изд. Всемирная организация здравоохранения, Женева, 2020, 124 c. URL: https://www.who.int/ru/publications/i/item/9789240011311.

³The Department of Defense’s Inquiry into Project 112/Shipboard Hazard and Defense (SHAD) Test. Committee on Armed Services, United States Senate. 2002.

⁴Antibiotic Resistance Threats in the United States, 2019. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, CDC. 2019. DOI: 10.15620/cdc:82532

⁵Указ Президента Российской Федерации «Об Основах государственной политики Российской Федерации в области обеспечения химической и биологической безопасности на период до 2025 года и дальнейшую перспективу». (Электронный ресурс.) URL: http://kremlin.ru/acts/bank/44066 (дата обращения: 19.01.2026).

⁶Указ Президента Российской Федерации от 31.03.2023 № 229 «Об утверждении Концепции внешней политики Российской Федерации». URL: http://www.kremlin.ru/acts/bank/49090 (дата обращения: 19.01.2026).

⁷«Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года». (Электронный ресурс.) URL: http://static.government.ru/media/files/onJ3GY3ObDGqLDvrED7AhpLF3ywRRFpp.pdf (дата обращения: 19.01.2026).