Иммунологические исследования в ревматологической клинике. Путь длиной в семь десятилетий | Головизнин М.В., Тимофеев В.Т., Лахонина Н.С., Булдакова Ю.Р.

Открытие аутоантител стимулировало углубление изучения иммунных реакций в клинике и поставило на повестку дня понятие базисной иммуномодулирующей терапии, которая зародилась именно в ревматологии как метод лечения ЗСТ. Пути развития иммуномодулирующей терапии в ревматологии имели немало парадоксов, проб и ошибок. Такие антиревматоидные модифицирующие течение болезни препараты, как делагил, сульфасалазин, пеницилламин, внедренные в клинику в середине ХХ в., изначально считались этиотропными на основании устаревших и отвергнутых ныне представлений об инфекционной (бактериальной или паразитарной) природе РА. Тем не менее они продемонстрировали значимый клинический эффект и снижение уровня аутоантител на фоне терапии. В то же самое время «научно обоснованное» с теоретической точки зрения применение гормонов тимуса в ревматологической клинике на практике оказалось намного менее успешным. Наконец, последние полтора десятилетия ознаменовались появлением избирательной (таргетной) иммунотерапии, о которой речь пойдет ниже.

    Тимус в ревматологической клинике. Орган, который долгое время не замечали

    Установление центральной роли тимуса в становлении клеточной системы иммунитета в середине прошлого века пробудило большой интерес к вилочковой железе со стороны врачей разных специальностей, включая ревматологов. Уже в 1970–1980-е гг. появилась возможность сгруппировать целый ряд заболеваний и синдромов, при которых обнаруживались те или иные морфологические изменения в вилочковой железе (табл. 2). Как оказалось, аутоиммунные и ревматические болезни занимают в этой группе одно из ведущих мест.

    Если в педиатрической практике «клиническая тимология» стала формироваться в рамках проблемы первичных иммунодефицитов, то у взрослых, как видно из таблицы 2, на первый план выступила тимомегалия и опухоли тимуса (тимомы). Тимомы взрослых не менее чем в 40% случаев сочетаются с АИЗ, из которых на первом месте стоит тяжелая миастения — неврологическое АИЗ, связанное с выработкой аутоантител к холинорецепторам. Примерно у 30% больных тимомой выявляется миастения, у 23% — РА в сочетании с синдромом Шегрена или без него. СКВ, кожные аутоиммунные и аутовоспалительные болезни (пузырчатка, пемфигоид, красный плоский лишай, кожно-слизистый кандидоз) выявляются примерно у 20% больных тимомой, гипогаммаглобулинемия — у 6%. Неспецифический язвенный колит и болезнь Крона в сочетании с тимомой представлены в литературных публикациях в виде описания клинических случаев. Вышеуказанные данные позволяют утверждать, что системные ЗСТ при тимомах нередко проявляются в виде «микстов» — сочетаний нескольких аутоиммунных синдромов. Напротив, прицельное морфологическое исследование тимуса при АИЗ почти всегда выявляло те или иные отклонения от нормы.
    В этой связи логично полагать, что для морфофункциональной оценки тимуса in vivo необходим комплексный подход, который, наряду с лабораторным тестированием функции Т-клеток и уровня тимических гормонов, включил бы ультразвуковые исследования, компьютерную томографию, магнитно-резонансную томографию, медиастиноскопию с биопсией, радионуклидное сканирование тимуса с помощью изотопов галлия и технеция. Однако до настоящего времени этот комплексный подход к патологии тимуса так и не вышел за пределы онкогематологии. Это связано, во-первых, с анатомическими трудностями визуализации (а также физикальных методов исследования) неувеличенного тимуса у взрослых лиц, включая подростков, во-вторых, с утвердившимся мнением, что вилочковая железа в постпубертатном периоде подвергается инволюции и в возрасте 40–45 лет полностью замещается жировой тканью, что не всегда и необязательно сопровождается патологией. В-третьих, при наличии явной иммунопатологии, например системных АИЗ, одни морфологи на вскрытии видели уменьшение тимуса, другие — его гиперплазию. Иммунологи же долго не могли прийти к согласию относительно того, что первично, что вторично — является тимус пусковым фактором АИЗ или же их мишенью (аутоиммунный тимит). Затянувшиеся дискуссии и неопределенность их результата привели к тому, что на практике тимус словно перестали замечать. Даже в детской кардиохирургии до недавнего времени полная или частичная тимэктомия во время операции проводилась с чисто тактической целью — обеспечить оптимальный доступ к камерам сердца. Что касается клинической иммунологии АИЗ, то изучение Т-клеточного иммунитета сводилось к тестированию все возрастающего пула объектов иммунной периферии — популяций Т-лимфоцитов крови и иммунотропных молекул, секретируемых этими клетками. Таким образом, если, например, в неврологии и эндокринологии изучение центральных и периферических органов, а также связи между ними проходит достаточно пропорционально, то в клинической иммунологии сложился очередной парадокс в виде гигантского перекоса в сторону изучения периферийных феноменов и явной недооценки функции центра, в данном случае — тимуса. При этом фундаментальная иммунология все громче говорит о ведущей роли вилочковой железы и процессов, происходящих в ней, в патогенезе иммунопатологии взрослых, включающей в себя аутоиммунную патологию.
    Взаимопонимание между морфологами, иммунологами и клиницистами стало намечаться только в последние годы. Так, исследования, проведенные на большом аутопсийном материале, показали, что тимус сохраняет свою функциональную активность и у взрослого человека, а его полная инволюция происходит только в глубокой старости. Те дегенеративные изменения в тимусе, которые морфологи выявляли у умерших больных, оказались ранней (акцидентальной) инволюцией тимуса — следствием сопутствующих заболеваний.
    Патоморфологи пришли также к выводу, что гиперплазия тимуса при АИЗ имеет место не за счет истинного увеличения паренхимы органа, а за счет расширения внутридольковых периваскулярных пространств и накопления в них лимфоидных фолликулов. Эти феномены не представляют собой аутоиммунного тимита и не являются специфичными для АИЗ. Периваскулярные пространства тимуса отделены от истинной паренхимы тимических долек непрерывной мембраной, и процессы, происходящие в них, не затрагивают непосредственно саму вилочковую железу. Что касается истинной паренхимы тимуса, то при всех исследованных системных или органоспецифичных АИЗ в ней не отмечалось признаков воспаления, а была выявлена очаговая атрофия разной степени выраженности. Особенно тяжелая атрофия отмечалась при СКВ. Возникновение очагов атрофии в тимусе может не совпадать по времени с манифестацией АИЗ или значительно опережать ее [2].

    Каким образом атрофические процессы в тимусе могут влиять на генез АИЗ?

    Ответить на этот вопрос стало возможным в связи с установлением стадий процесса созревания Т-клеток. Показано, что созревание Т-лимфоцитов в тимусе проходит в два больших этапа. Во-первых, в ходе положительной селекции в кортикальном слое тимуса незрелые протимоциты, прилипая к эпителиальным клеткам коры тимуса, экспрессируют свой главный Т-клеточный рецептор. Во-вторых, созревшие тимоциты переходят в медуллярную зону тимуса и претерпевают отрицательную селекцию, в ходе которой Т-клоны, имеющие высокоаутореактивные рецепторы, удаляются путем апоптоза. Таким образом, в норме в периферическую кровь проникают Т-лимфоциты, имеющие как бы среднюю по выраженности аутореактивность, которая недостаточна для аутоагрессии, но способна обеспечить кооперацию с другими клетками иммунной системы, необходимую для иммунного ответа. Наконец, именно в тимусе созревает популяция Т-регуляторных клеток, которые на данном этапе развитя науки считаются супрессорами иммунного ответа. Было также показано, что инволюция и атрофия тимуса не приводят к полному прекращению развития Т-клеток. Т-клеточная селекция может происходить и на периферии, в тканях, генетически родственных тимусу (кожа, другие виды эпителия). Хотя такое Т-клеточное развитие не является полноценным и происходит в гораздо более медленном темпе, оно в какой-то мере компенсирует недостаток тимической дифференцировки.
    В связи с вышесказанным можно сделать предположение, что очаговая атрофия тимического эпителия в кортикальной или медуллярной зоне вилочковой железы ведет к прекращению или извращению отдельных этапов Т-клеточного созревания. Несозревшие Т-клетки, возможно, попадают на периферию. В этих условиях роль стимуляторов созревания Т-лимфоцитов могут брать на себя другие ткани. Большая часть антигенов тимуса, обеспечивающих созревание Т-лимфоцитов, может выявляться и на периферии. Так, особенностью аутоиммунного воспаления является аномальная экспрессия на периферических клетках иммунотропных белков — HLA-антигенов II класса (на синовиоцитах суставов больных РА, на кератиноцитах кожи при псориазе, на клетках тубулярного эпителия почек при СКВ). Эти белки в норме присутствуют только на клетках иммунной системы и, в частности, опосредуют созревание тимоцитов в тимусе. Подобный феномен (не получивший до настоящего времени убедительного объяснения) нехарактерен для «банальных» воспалительных процессов бактериальной природы [3]. Если вышесказанное верно, то процессы периферического Т-клеточного онтогенеза, происходящие вне гемато-тимического барьера, должны приводить к повреждению окружающих тканей вследствие выброса разнообразных цитокинов и адгезивных межклеточных взаимодействий. Более того, аутореактивные Т-клоны с необычным, «незрелым» фенотипом обнаружены в очагах аутоиммунного воспаления при РА, СКВ, псориазе, неспецифическом язвенном колите и других АИЗ. Вирусная теория происхождения АИЗ до сих пор обсуждается в научной литературе. Сказанное выше позволяет по-иному взглянуть на проблему асептического воспаления тимуса (вирусного тимита), последствия которого (в виде очаговой атрофии коры или мозгового вещества) можно рассматривать как своеобразный мостик к АИЗ, даже если между вирусной инфекцией тимуса и манифестацией АИЗ имеется большой временной промежуток.

    Исследование клеточного иммунитета в клинической практике. 

    Иммунологический сизифов труд и поиск выхода из этой ситуации

    Анатомо-физиологический разрыв между иммунологическим центром и периферией не преодолен до настоящего времени. В практической иммунологии изучение Т- и В-клеточного иммунитета большей частью сводится к тестированию все возрастающего пула объектов иммунной периферии — популяций Т-лимфоцитов циркулирующей крови, составляющих около 5% от общего пула лимфоцитов, а также цитокинов, хемокинов, медиаторов внутриклеточного сигнала и других молекул, секретируемых этими клетками. Тем не менее хотя периферическая кровь в конкретный момент времени содержит небольшой процент клеток лимфоцитарного пула, их исследование имеет большое клиническое значение. Кровь является средством транзита иммунокомпетентных клеток (ИКК) между иммунными органами и очагами воспаления. В связи с этим мы вправе ожидать, что в состоянии транзита находятся наиболее активные компоненты иммунной системы.
    Известно, что до 80% иммунных клеток человека находятся в лимфоидных железах кишечника, но в клинике подходы к изучению иммунной системы кишечника до сих пор не выработаны даже при таких болезнях, как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона. Мембранные рецепторы ИКК объединены в настоящее время в систему «кластеров дифференцировки» (антигенов CD), которых насчитывается около трех сотен, притом что эта система регулярно пополняется вновь открытыми молекулами. По образному выражению видного российского иммунолога проф. И.Г. Козлова, «система CD-антигенов, с которой сталкивается теперь каждый иммунолог, пока не дождалась своего Менделеева. Она пополнялась, пополняется и будет пополняться; искать в ней какую-то систему можно весьма относительно. Этот хаос на самом деле может наступить, до него осталось не так далеко. В соответствии с правилами комбинаторики утверждается, что количество клеток в нашем организме значительно меньше, чем количество возможных комбинаций их поверхностных рецепторов…» [4]. Данная ситуация прежде всего проявляется в крайне высокой вариабельности показателей клеточного иммунитета в норме. Разбросы этих данных у здоровых доноров оказались настолько значительны, что позволило некоторым исследователям трактовать «иммунологическую норму» как сугубо индивидуальный феномен для каждого конкретного человека [5].
    Сложность интерпретации лабораторных данных в клинической иммунологии связана еще и с тем, что она за последние 40–50 лет несколько раз практически полностью обновляла комплекс исследовательских методик. На смену морфологическим способам оценки иммунных клеток, которые практиковались в 1960-х гг., пришли методики розеткообразования, основанные на анализе «розеток» — ассоциатов между лимфоцитарными популяциями и различными видами эритроцитов (барана, человека, мыши). В 1980–1990-е гг. на смену им пришли методы изучения мембранных клеточных рецепторов с помощью моноклональных антител, основанные вначале на иммунофлуоресценции, затем на проточной цитометрии. При этом данные большого количества научных и практических исследований, полученные на каждом из предшествующих этапов, в связи с «недостаточной научностью», малой сопоставимостью с данными, полученными на новом этапе, как бы забывались, и процесс накопления информации начинался, по сути, с чистого листа. Так происходило и в нашей стране, и в мировой практике. Этот сизифов труд лабораторной иммунологии на деле явился большим препятствием для адаптации иммунологических методик в клинике, в частности в ревматологии, порождая диагностический нигилизм. Этот последний в конце прошлого века поставил под сомнение целесообразность применения тестов для исследования клеточного иммунитета в клинической практике за исключением ситуаций, связанных с первичными и вторичными иммунодефицитами (включая ВИЧ-инфекцию), при которых иммунологические изменения должны быть заведомо очень грубыми.
    Настоятельная необходимость лабораторной иммунодиагностики в клинической практике была вновь поставлена на повестку дня, опять-таки в ревматологической клинике уже в наши дни, в связи с внедрением терапии ЗСТ генно-инженерными биологическими препаратами (ГИБП), к которым, в частности, относятся моноклональные антитела к В-клеточным рецепторам (ритуксимаб), к цитокинам, таким как фактор некроза опухолей, интерлейкин-6 и др. (инфликсимаб, адалимумаб). Терапия ГИБП, казалось, воплотила в жизнь чаяния нескольких поколений клинических иммунологов о целевом (точечном, таргетном) воздействии на иммунную систему, при котором эффект лечения был бы узко направлен на ее патологическое звено, не затрагивая нормальные компоненты. Однако оказалось, что ГИБП, особенно при повторных применениях, отнюдь не лишены серьезных побочных эффектов, среди которых выделяется манифестация туберкулезного процесса, другие инфекционные осложнения, а также опухоли и аутоиммунные синдромы. Данная ситуация явила еще один медицинский парадокс: внедрение лечебных методик в практику нередко опережает фундаментальные исследования, направленные на всестороннее изучение немедленных и отдаленных последствий этих методов. Действительно, этиология системных ЗСТ, несмотря на гигантский прогресс биомедицины, остается неизвестной, а патогенез изучен лишь фрагментарно. В связи с этим исследователи и клиницисты лишены возможности прогнозировать и предусмотреть все последствия подавления синтеза определенных цитокинов или клеточных популяций иммунной системы.
    Сказанное выше позволяет сформулировать один существенный вывод: даже если терапия ГИБП является таргетной, узконаправленной на патологическое звено иммунной системы, то метод оценки ее иммунотропного эффекта должен быть комплексным, чтобы предотвратить как можно большее число нежелательных побочных эффектов, связанных с воздействием на иммунную систему. Нам представляется целесообразным воспроизвести ниже несколько правил и подходов к анализу иммунограммы периферической крови при острых и хронических воспалительных процессах, выработанных К.А. Лебедевым и И.Д. Понякиной в начале 1990-х гг. [5]. Важно, что эти правила были сформулированы в «переходный период», когда методы розеткообразования в клинической иммунологии уступали место технологиям определения клеточных рецепторов с помощью моноклональных антител, поэтому правила учитывают как старые, так и новые методики. Они вполне актуальны для оценки иммунной системы больных ЗСТ.
    Правило 1. Комплексный анализ иммунограммы более информативен, чем оценка каждого показателя в отдельности.
   Правило 2. Полноценный анализ иммунограммы возможен лишь в комплексе с оценкой клинической картины у данного пациента. Иммунограмма даже при наличии самых резких сдвигов не может дать окончательного ответа при диагностике или прогнозировании течения заболевания без глубокого сопоставления ее с клинической картиной заболевания у данного больного. Поэтому необходим обязательный совместный анализ иммунограммы врачом-лаборантом и врачом-клиницистом, ведущим больного (т. е. необходимо восстановление тех принципов, которые были обязательными для анализа картины крови до 1940-х гг. во всех отечественных клиниках).
    Правило 3. Реальную информацию в иммунограмме несут лишь сильные сдвиги показателей. Это зависит от уровня показателя: чем значение показателя ниже, тем сильнее должна быть интенсивность его изменения.
    Правило 4. Анализ иммунограммы в динамике всегда более информативен как в диагностическом, так и в прогностическом отношении, нежели однократно полученная иммунограмма.
    Правило 5. В подавляющем большинстве случаев анализ иммунограммы дает возможность делать ориентировочные, а не безусловные выводы диагностического и прогностического характера.
    Правило 6. В заключении, составляемом на основании анализа иммунограммы, ведущим является наличие ярко выраженных клинических симптомов. И напротив, отсутствие сдвигов иммунограммы, например при наличии клинической картины воспалительного процесса, должно трактоваться как атипичность реакции иммунной системы и отягощающий признак течения процесса.
    Правило 7. Для диагностической и прогностической оценки иммунограммы важнейшее значение имеют индивидуальные показатели нормы данного пациента.
    Можно констатировать, что эти правила прежде всего призывают к восстановлению тесного сотрудничества клиницистов и врачей-иммунологов, работающих в лабораториях. К сожалению, развитие специализации в медицине привело к тому, что нередко врачи лабораторной диагностики утрачивают навыки работы с пациентом и элементы клинического мышления, а клиницисты, не имея возможности следить за возрастающим валом иммунологических публикаций, не обладают необходимым уровнем знаний современной иммунологии.

    Иммунограмма периферической крови в современной ревматологической клинике

    Если приведенные выше правила применить к условиям ревматологической клиники, точнее, к больным системными ЗСТ, то показатели гуморального иммунитета (прежде всего аутоантитела) можно использовать для диагностики и дифференциальной диагностики, в то время как факторы клеточного иммунитета более целесообразно применять для оценки динамики воспаления и контроля за проводимой иммунотропной терапией. На рисунке 1 представлена динамика основных показателей клеточного иммунитета при остром воспалительном процессе. В ревматологичекой клинике в эту группу нозологий могут входить острая ревматическая лихорадка, болезнь Кавасаки и другие аутовоспалительные синдромы.

    Как видно из рисунка, разнонаправленные колебания показателей клеточного иммунитета, во-первых, зависят от клинической фазы воспаления, во-вторых, отражают различную роль иммунных клеток на разных его этапах. При хроническом иммунном воспалении, лежащем в основе патогенеза ЗСТ, динамика иммунных клеток будет отличаться от вышеприведенной. Если учитывать более современные данные иммунологии по субпопуляционному составу ИКК при системных аутоиммунных ЗСТ, то эти субпопуляции целесообразно разделить на три категории.
    Для исследования базовых показателей иммунного статуса и выявления выраженных иммунных нарушений в соответствии с рекомендациями ВОЗ целесообразно определение молекулярных маркеров CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+56, соотношение CD4/CD8. Исследование позволяет определить количество основных популяций лимфоцитов: Т-клетки — CD3, В-клетки — CD19, натуральные киллеры (NK) — CD3-CD16+CD 56+, субпопуляции Т-лимфоцитов (Т-хелперы CD3+CD4+, Т-цитотоксические CD3+CD8+ и их соотношение). Эти клетки представляют собой каркас иммунной системы, нормальные значения которых стандартизированы. Их существенное отклонение от нормы сочетается с клиникой тяжелой иммунопатологии, прежде всего иммунодефицитных состояний [6].
    Активированные лимфоциты с фенотипом CD69+, CD3+HLA-DR+, CD8+CD38+, CD19+CD38+. Тест отражает функциональное состояние активированных Т- и В-лимфоцитов и рекомендован для контроля течения заболевания и контроля иммунотерапии при воспалительных заболеваниях. Уровень этих клеток повышен при хронических аутоиммунных и аутовоспалительных синдромах.
    Так называемые «минорные» субпопуляции, уровень которых в норме колеблется в пределах 1–3% [7]. Среди них встречаются Т-клетки с необычным «тимоцитарным» фенотипом CD3+ CD4- CD8-. Эти Т-клетки, имеющие особый антигенраспознающий рецептор (ТкР гамма/дельта), принадлежат к лимфоцитам врожденного иммунитета, которые могут находиться в активированном состоянии длительное время и таким образом поддерживать хроническое иммунное воспаление. Хотя их процент от общего лимфоцитарного пула невелик (1–2%), у некоторых больных РА, имеющих внесуставные проявления и высокий титр ревматоидного фактора, их содержание в крови может возрастать в несколько раз, достигая 10 и даже 20%. Содержание зрелых Т-лимфоцитов при этом снижается.
    И наконец, нужно сказать, что в последнее время иммунологи создали действенные лабораторные методы оценки функции тимуса in vivo, связанные с определением фенотипа и генетических маркеров Т-клеток, недавно покинувших вилочковую железу, — «недавних тимических эмигрантов» [8]. Эти клетки также принадлежат к «минорным» Т-клеточным субпопуляциям и имеют особый рецепторный фенотип (CD4+CD31+), а также высокий уровень Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК) — эписомальных фрагментов ДНК, образующихся при реаранжировке генов альфа-цепи Т-клеточного рецептора. Эти кольца определяются с помощью полимеразной цепной реакции. Высокое содержание ТРЭК свойственно лишь «недавним тимическим эмигрантам». У младенцев, детей и подростков уровень ТРЭК в лимфоцитах высок [9]. Это послужило основанием для использования ТРЭК при оценке результатов неонатальной тимэктомии. Однако факты свидетельствуют, что у здоровых взрослых лиц, включая пожилых, уровень ТРЭК в лимфоцитах крови поддается определению, хотя он в несколько раз меньше, чем у детей. Таким образом, сохранность или нарушение процессов созревания Т-лимфоцитов в тимусе при системных ЗСТ могут быть действенно подтверждены у человека in vivo с помощью лабораторных методик. На наш взгляд, это создает условия для восстановления морфофункционального принципа оценки работы иммунной системы в целом.