Частота распространения устойчивых к карбапенемам штаммов грамотрицательных бактерий в многопрофильном детском стационаре | Боронина Л.Г., Саматова Е.В., Блинова С.М., Кукушкина М.П., Панова С.А., Устюгова С.С.

Введение

Резистентность бактерий к антибиотикам является проблемой во всем мире. Одним из важнейших ее аспектов считается появление и распространение устойчивости грамотрицательных микроорганизмов к карбапенемам, которые ранее считались одними из надежных антимикробных препаратов (АМП) в большинстве клинических случаев, особенно при серьезных нозокомиальных инфекциях [1, 2]. Среди грамотрицательных бактерий наиболее частыми возбудителями внутрибольничных инфекций, в т. ч. сепсиса, пневмонии, инфекций мочевыводящих путей, являются представители порядка Enterobacterales, среди которых лидируют, несомненно, Klebsiella pneumoniae  и неферментирующие грамотрицательные бактерии — Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii [3].

Снижение чувствительности энтеробактерий к карбапенемам может быть связано с гиперпродукцией хромосомных β-лактамаз Amp C или β-лактамаз расширенного спектра в сочетании с нарушением проницаемости клеточной стенки, потерей пориновых каналов, а также с ферментативной инактивацией антибиотика за счет продукции карбапенемаз [2]. В свою очередь, устойчивость P. aeruginosa к карбапенемам может быть также связана с нарушением транспорта препарата внутрь клетки в результате мутаций, ведущих к потере имипенем-специфического мембранного порина OprD [1]. Однако считается, что преимущественно резистентность к карбапенемам обусловлена продукцией карбапенемаз. Причины нечувствительности к данной группе антибиотиков у A. baumannii разнообразны и включают в себя также изменение проницаемости наружной клеточной мембраны, эффлюкс, продукцию приобретенных карбапенемаз (металло-β-лактамаз и ОХА-карбапенемаз), гиперпродукцию видоспецифических β-лактамаз (ОХА-51 и родственных ферментов) [4].

В феврале 2017 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) впервые представила перечень резистентных микроорганизмов, представляющих огромную опасность для общественного здоровья, где среди грам­отрицательных бактерий лидируют карбапенемазорезистентные штаммы A. baumannii и P. aeruginosa, а также представители порядка Enterobacterales, продуцирующие β-лактамазы расширенного спектра и карбапенемазы [5]. Важным является тот факт, что гены, ответственные за продукцию карбапенемаз, часто входят в состав интегронов, легко встраивающихся в плазмиды и транспозоны. Обмен мобильными генетическими элементами внутри популяции одного вида, а также между различными видами бактерий приводит к быстрому распространению устойчивых штаммов [1, 3].

Условием повышения качества оказания медицинской помощи и предотвращения возникновения и распространения инфекционных заболеваний, в частности инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, является раннее выявление грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы, путем постоянного мониторинга антибиотикорезистентности возбудителей инфекции.

Целью нашего исследования явилось определение частоты обнаружения карбапенемазопродуцирующих штаммов грамотрицательных бактерий (A. baumannii и P. aeruginosa, порядка Enterobacterales) в биопробах госпитализированных детей.

Материал и методы

В период с января по декабрь 2019 г. было исследовано 6100 проб различного клинического материала (кроме образцов кала) 2483 пациентов ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница», госпитализированных в отделение анестезиологии и реанимации, отделение анестезиологии и реанимации и интенсивной терапии новорожденных и недоношенных детей № 2, онкогематологический центр, отделение патологии недоношенных, отделение торакальной хирургии и хирургическое отделение для новорожденных больных, нефрологическое и нев­рологическое отделения.

Отбор клинического материала и бактериологическое исследование проводили согласно общепринятым методам [6].

Для посева крови, забранной из интактной вены и (или) катетера, использовались: системы для гемокультур Signal (Oxoid, Великобритания), флаконы для автоматического анализатора гемокультур BACTEC^TMFX (Becton Dickinson, США), бульон с сердечно-мозговым экстрактом с 0,025% SPS, СО₂ и вакуумом (Conda, Испания). При культуральном исследовании спинномозговой жидкости использовали модифицированный посев согласно нормативной документации [7]: чашки с шоколадным и кровяно-сывороточным агарами (оригинальные рецепты) [8, 9] инкубировали при 35 °C в атмосфере 5% СО₂ в течение 48 ч; 0,1% полужидкий сывороточный агар при 37 °C в течение 5 сут с ежедневным наблюдением. Посев катетеров осуществлялся полуколичественным методом по D. Maki на кровяно-сывороточный агар (инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% СО₂ в течение 72 ч) и погружением катетера в сахарный бульон для изучения его внутреннего канала (инкубация при 37 °C в течение 3 сут с ежедневным наблюдением). Пунктаты и экссудаты засевали на кровяно-сывороточный агар (инкубация при 37 °C в атмосфере О₂ в течение 48 ч), кровяно-сывороточный агар (свежеприготовленный, инкубация при 37 °C в анаэробных условиях в течение 7 сут), прорегенерированную тиогликолевую среду и двухфазную среду, включающую твердый питательный агар и бульон (инкубация при 37 °C в атмосфере О₂ в течение 5 сут) с ежедневным наблюдением. На питательные среды Эндо, желточно-солевой, кровяно-сывороточный, шоколадный агары (помещаются в атмосферу 5% СО₂) и агар Сабуро осуществлялся посев мокроты и бронхоальвеолярного лаважа количественным методом, а содержимого трахеи — полуколичественным [10]. Пробы с отделяемым ран, конъюнктивы дополнительно засевали на прорегенерированную тиогликолевую среду. Посев мочи осуществлялся по методу Айзенберга на 5% кровяной агар [11]. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили классическим бактериологическим методом, а также на полуавтоматическом анализаторе ATB Ex * pression (bioMerieux, Франция) и автоматическом анализаторе Phoenix M50 (Becton Dickinson, США). Определение антибиотикочувствительности проводили как диско-диффузионным методом, так и на полуавтоматическом SENSITITRE (TREC Diagnostic Systems, США/Великобритания) и автоматическом Phoenix M50 (Becton Dickinson, США) анализаторах с определением минимальных подавляющих концентраций. Выполнение и оценка антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом проводились в соответствии с действующей нормативной документацией [12]. Для выявления продукции карбапенемаз без их дифференциации у P. aeruginosa и представителей порядка Enterobacterales применялся фенотипический метод инактивации карбапенемов (Carbapenem Inactivation Method, CIM) [13]. Для обнаружения грамотрицательных бактерий, резистентных к карбапенемам, независимо от механизма резистентности при первичном посеве клинического материала онкологических больных использовали среду CHROMagar^TM KPC (DRG, Франция).

Результаты исследования и их обсуждение

Согласно информации, представленной экспертами ВОЗ, к группе первоочередной важности среди резистентных грамотрицательных бактерий отнесены A. baumannii, P. aeruginosa и представители порядка Enterobacterales, поэтому в исследование включены штаммы указанных видов и порядка.

Источниками выделения этих изолятов были кровь (n=8), спинномозговая жидкость (n=2), содержимое трахеи (n=67), моча (n=36), отделяемое ран (n=10) и конъюнктивы (n=2), мокрота (n=4), выпот из плевральной полости (n=1), отделяемое из ротоглотки (n=1), аутопсийный материал — ткань легких (n=1).

С января по декабрь 2019 г. из клинического материала 900 пациентов было выделено 940 штаммов грам­отрицательных бактерий (табл. 1). Небольшая доля протестированных на чувствительность к дорипенему изолятов обусловлена тем, что этот АМП входит только в часть коммерческих панелей, использованных в работе. Суммарная доля карбапенемонечувствительных штаммов грамотрицательных бактерий (резистентные и умеренно резистентные к меропенему и (или) имипенему у P. aeruginosa, A. baumannii или эртапенему у энтеробактерий) составила 14% (n=132). Устойчивость представителей порядка Enterobacterales к эртапенему составила 12,1%, что ниже, чем в целом по России (23,6%) [14, 15]. Наиболее высокая частота нечувствительности к данному АМП была отмечена среди изолятов K. pneumoniae — 29,4%, что все равно ниже, чем показатели в целом по России (41,6%) [15]. Среди всех изолятов энтеробактерий устойчивость к имипенему и меропенему проявляли 17,2% и 20% соответственно, среди изолятов K. pneumoniae — 35,5% и 44,7% соответственно. Полученная в нашем исследовании частота распространения устойчивых к имипенему и меропенему штаммов K. pneumoniae выше общероссийских показателей. В целом по России резистентность для всех энтеробактерий к имипенему составляла 6,9%, к меропенему — 6,5%, для изолятов K. pneumoniae — 11,9% и 12,2% соответственно [15]. Это можно объяснить тем, что при определении чувствительности к карбапенемам у представителей порядка Enterobacterales диско-диффузионным методом в первую очередь тестировался эртапенем; некоторые изоляты, обладающие β-лактамазами расширенного спектра и AmpC, могут проявлять устойчивость к нему и в отсутствие карбапенемаз [16]. При выявлении умеренной резистентности или резистентности у энтеробактерий к эртапенему определялась чувствительность к меропенему и имипенему, а также проводился CIM-тест. Доли штаммов P. aeruginosa, устойчивых к меропенему и имипенему, были по 50,9% соответственно, к дорипенему — 45%, что в целом ниже, чем по России (согласно данным исследования «МАРАФОН» 2015–2016 гг., доля резистентных изолятов к имипенему составляла 67,5%, к меропенему — 55,5%) [17]. Доля штаммов
A. baumannii, устойчивых к меропенему, составляла 66,6%, к имипенему — 63,6%, к дорипенему — 83,3%, что было ниже, чем по России в целом (по данным исследования «МАРАФОН» 2015–2016 гг., доля резистентных изолятов к имипенему равнялась 77,5%, к меропенему — 77,2%) [18], но выше, чем по отдельным городам Так, в многопрофильных стационарах Санкт-Петербурга доля меропенем-устойчивых штаммов A. baumannii составила 41,4%, а имипенем-устойчивых — приблизилась к 50% [19].

Видовой состав карбапенем-устойчивых штаммов грам­отрицательных бактерий включал: P. aeruginosa (n=55), A. baumannii (n=22), Escherichia coli (n=2), K. pneumoniae (n=40), Klebsiella oxytoca (n=1), Enterobacter cloacae (n=7), Serratia marcescens (n=2), Proteus mirabilis (n=2), Pseudomonas putida (n=1).

Устойчивые (резистентные и умеренно резистентные) к карбапенемам изоляты выделялись у пациентов преимущественно со следующими диагнозами: оперированный врожденный порок сердца, врожденные пороки развития, острый лейкоз, саркома, поражение центральной нервной системы, бронхолегочная дисплазия, пневмония, хронический обструктивный бронхит, хроническая почечная недостаточность, инфекция мочевыводящих путей. Таким образом, можно сделать заключение, что такие штаммы наиболее часто выделяются у пациентов: 1) длительно и неоднократно находящихся на лечении в стационаре, и, как правило, не в одном; 2) подвергшихся полостным операциям; 3) получающих массивную антибактериальную терапию; 4) паллиативных пациентов.

Все штаммы P. aeruginosa, устойчивые к карбапенемам, были резистентны или умеренно резистентны к меропенему и имипенему. Один изолят A. baumannii был умеренно резистентный к меропенему, но чувствительный к имипенему. Мы установили, что 67,5% штаммов K. pneumoniae были одновременно устойчивы ко всем карбапенемам: эртапенему, меропенему и имипенему, что, вероятно, вызовет необходимость тестирования K. pneumoniae на чувствительность ко всем трем АМП одновременно. У пяти пациентов одновременно были обнаружены несколько видов грамотрицательных бактерий, устойчивых к карбапенемам: P. aeruginosa + A. baumannii (n=2), K. pneumoniae + P. aeruginosa (n=3). Все эти пациенты находились в отделении анестезиологии и реанимации с диагнозами: хронический обструктивный бронхит, бронхолегочная дисплазия, острое поражение центральной нервной системы, острая гнойно-деструктивная пневмония.

Часто карбапенемазопродуцирующие штаммы грам­отрицательных бактерий имеют фенотип множественной резистентности к антимикробным препаратам (multiple drug resistance, MDR), т. е. нечувствительны как минимум к трем АМП, относящимся к различным классам [3]. В нашем исследовании такие штаммы были среди P. aeruginosa (n=32), A. baumannii (n=15) и K. pneumoniae (n=29). Главным образом такие изоляты обнаружены у детей отделений анестезиологии и реанимации, онкогематологических больных и пациентов, находящихся на гемодиализе при хронической почечной недостаточности.

Для определения экстремальной лекарственной резистентности (extensively drug resistance, XDR) или панрезистентности (pandrug resistance, PDR), согласно экспертной группе Европейского общества по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases), у бактерий порядка Enterobacterales предложено использовать 17 групп АМП, содержащих 28 АМП, у P. aeruginosa — 8 групп (17 АМП) и у A. baumannii — 9 групп (22 АМП) [3]. В лаборатории такое количество антибиотиков рутинно не тестируется, поэтому достоверно выявить количество штаммов с XDR- и PDR-фенотипом резистентности в нашем исследовании не удалось.

При определении продукции карбапенемаз наиболее распространенными из фенотипических методов имеются ограничения: так, CIM-тест рассчитан на определение карбапенемаз у представителей порядка Enterobacterales и P. aeruginosa [2].

Не один фенотипический метод не обладает 100% чувствительностью. По литературным данным, CIM-тест обладает чувствительностью 82% [2, 20]. Существует метод, когда для приготовления суспензии тестируемого изолята стерильную дистиллированную воду или 0,9% физиологический раствор заменяют на триптиказо-соевый бульон, что повышает чувствительность до 93%, но в рутинной практике этот дорогостоящий метод не используется [2]. В настоящее время «золотым стандартом» обнаружения продуцентов карбапенемаз являются молекулярные методы [2].

Для быстрого выявления продукции карбапенемаз может применяться хромогенная среда CHROMagar KPC, чувствительность которой, по данным зарубежных исследователей, варьирует в широких пределах — от 43% до 100%. По результатам исследования НИИ антимикробной химиотерапии СГМУ чувствительность данной среды для выявления карбапенемаз класса D (OXA-48) составляет 87,7% [20]. Бесспорным преимуществом является то, что результат можно получить уже на следующий день с момента посева клинического материала.

У одного из штаммов P. aeruginosa CIM-тест был положительный, другим фенотипическим методом (анализатором Phoenix M50) не выявлен факт наличия карбапенемаз, а при исследовании на хромогенной среде CHROMagar KPC культура P. aeruginosa дала рост, что свидетельствует в пользу продукции карбапенемазы у данного штамма.

Из всех штаммов P. aeruginosa и A. baumannii, протестированных фенотипическим методом, у 30,4% (P. aeruginosa [n=11] и A. baumannii [n=3]) продукция карбапенемазы не была выявлена, что скорее свидетельствует о других механизмах резистентности к карбапенемам.

Заключение

Устойчивость представителей порядка Entero-bacterales к эртапенему наблюдалась у 12,1% выделенных штаммов. Наиболее высокая частота нечувствительности к данному АМП была отмечена среди изолятов K. pneumoniae — в 29,4% случаев. Среди всех изолятов энтеробактерий устойчивость к имипенему и меропенему проявляли 17,2% и 20% штаммов соответственно. Мы установили, что 50,9% штаммов P. aeruginosa были устойчивы к меропенему и имипенему и 45% — к дорипенему. Штаммы A. baumannii были устойчивы к меропенему в 66,6% случаев, к имипенему — в 63,6%, к дорипенему — в 83,3%. Из всех штаммов P. aeruginosa и A. baumannii, протестированных фенотипическим методом, у 30,4% (P. aeruginosa [n=11] и A. baumannii [n=3]) продукция карбапенемазы не была выявлена, что скорее свидетельствует о других механизмах резистентности к карбапенемам. Фенотипические методы в большинстве случаев лишь позволяют заподозрить наличие тех или иных механизмов приобретенной резистентности. Однако, поскольку основным и наиболее частым механизмом является выработка гидролитических ферментов, выявление механизмов резистентности к карбапенемам должно быть направлено именно на это. В настоящее время помимо фенотипических методов оптимальным является использование молекулярных методов, в частности ПЦР в реальном времени, для осуществления эффективного надзора за распространением продуцентов карбапенемаз. Таким образом, успешная работа системы инфекционного контроля, включающая совместную работу бактериолога, клинического фармаколога и эпидемиолога, позволяет контролировать распространение резистентных штаммов, назначать этиотропную антибиотикотерапию и предотвращать нозокомиальное инфицирование.

Сведения об авторах

Боронина Любовь Григорьевна — д.м.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России; 620028, Россия, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3; ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32; ORCID iD 0000-0003-0152-962X.

Саматова Елена Валерьевна — к.м.н., врач-бактериолог лаборатории клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32; ORCID iD 0000-0003-3154-6201.

Блинова Светлана Михайловна — ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России; 620028, Россия, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3; ORCID iD 0000-0003-4783-825X.

Кукушкина Марина Павловна — заведующая лабораторией клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32; ORCID iD 0000-0003-1980-9099.

Панова Светлана Анатольевна — врач-бактериолог лаборатории клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32; ORCID iD 0000-0003-4347-0929.

Устюгова Светлана Сергеевна — врач-бактериолог лаборатории клинической микробиологии ГАУЗ СО «ОДКБ»; 

620149, Россия, г. Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32; ORCID iD 0000-0002-0053-4884.

Контактная информация: Саматова Елена Валерьевна, e-mail: lavrinenko@eka-net.ru. Конфликт интересов отсутствует. Прозрачность финансовой деятельности: авторы не имеют финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. Статья поступила 28.05.2020, поступила после рецензирования 25.08.2020, принята в печать 10.09.2020.

About the authors:

Lubov’ G. Boronina — Dr. of Sci. (Med.), Professor of the Department of Clinical Pathology Laboratory and Bacteriology, Ural State Medical University: 3, Repina str., 620028, Russian Federation; Regional Children’s Clinical Hospital: 32, S. Deryabinoy str., Ekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-0152-962X.

Elena V. Samatova — Cand. of Sci. (Med.), bacteriologist of the Clinical Microbiology Laboratory, Regional Children’s Clinical Hospital: 32, S. Deryabinoy str., Ekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-3154-6201.

Svetlana M. Blinova — Assistant Professor of the Department of Clinical Pathology Laboratory and Bacteriology, Ural State Medical University: 3, Repina str., Ekaterinburg, 620028, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-4783-825X.

Marina P. Kukushkina — Head of the Clinical Microbiology Laboratory, Regional Children’s Clinical Hospital: 32, S. Deryabinoy str., Ekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-1980-9099.

Svetlana A. Panova — bacteriologist of the Clinical Microbiology Laboratory, Regional Children’s Clinical Hospital: 32, S. Deryabinoy str., Ekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-4347-0929.

Svetlana S. Ustyugova — bacteriologist of the Clinical Microbiology Laboratory, Regional Children’s Clinical Hospital: 32, S. Deryabinoy str., Ekaterinburg, 620149, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-0053-4884.

Contact information: Elena V. Samatova, e-mail: lavrinenko@eka-net.ru. Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned. There is no conflict of interest. Received 28.05.2020, revised 25.08.2020, accepted 10.09.2020.