Перспективы использования индукторов интерферона на основе двуспиральной РНК для лечения вирусных и бактериальных инфекций | Радаева О.А., Таганов А.В., Рогожина Е.А.

Введение

Новый вектор развития вирусологии связывают с открытием «феномена невосприимчивости», впоследствии названного «вирусной интерференцией», суть которого заключается в подавлении размножения вируса, если клетка предварительно была инфицирована другим вирусом. Это открытие сделали в середине прошлого века A. Isaacs и M. Edney в эксперименте с куриным эмбрионом, когда исследователи обнаружили явление интерференции между инактивированным и активным вирусами гриппа. Был описан механизм этого феномена и его взаимосвязь с особым противовирусным белком «интерфероном», который, по мнению авторов, был меньше, чем иммуноглобулины, и подавлял активность различных вирусов [1–3].

В каждой клетке организма человека функционирует система интерферонов (ИФН), задача которой заключается в защите от вирусного воздействия посредством блокирования его внутриклеточного размножения. Алгоритм противовирусной защиты в системе ИФН включает индукцию, продукцию, действие различных типов ИФН.

Защита организма от инфекции. Роль ИФН

Представляя собой первую линию защиты организма от инфекции, ИФН на ранних стадиях инфекционного процесса начинают выполнять свою защитную функцию, в том числе посредством контрольно-регуляторных механизмов, а также усиливая действие лимфоцитов врожденного, а позже и адаптивного иммунитета. В ответ на вторжение чужеродных агентов (вирусы и др.) ИФН, являющиеся цитокинами, демонстрируют широкий диапазон противовирусной активности, подавляя размножение вирусов и обеспечивая защиту неинфицированных клеток. В исследованиях, посвященных изучению действия ИФН, установлено, что снижение их выработки вызывает нарушение иммунного гомеостаза, обусловленное дисбалансом взаимодействия иммунокомпетентных клеток, что в свою очередь приводит к ослаблению защитных механизмов и способствует развитию инфекционного процесса [4, 5].

Семейство рецепторов, распознающих двуспиральную РНК (дсРНК), представлено Толл-подобными рецепторами (TLR), которые относятся к трансмембранным сигнальным рецепторам, связывающим путем лиганд-рецепторного взаимодействия участки (консервативные) молекул вирусов и бактерий. Главную роль в идентификации вирусных дсРНК и передаче сигнала играет TLR 3-го типа (TLR3). TLR3 экспрессируется различными клетками иммунной системы и соматическими клетками (дендритные клетки, макрофаги, натуральные киллеры, Т-лимфоциты, фибробласты, астроциты, гепатоциты и др.) [6, 7]. В результате взаимодействия TLR3 с дсРНК происходит его димеризация, что приводит к его активации и, как следствие, к запуску внутриклеточных сигнальных путей и активации генов ИФН I типа и провоспалительных цитокинов [8, 9].

Индуцируемый клетками ИФН, в свою очередь, усиливает транскрипцию генов ИФН-зависимых ферментов, обусловливающих реализацию противовирусного ответа, в котором основными ферментами являются 2’,5’-олигоаденилатсинтетаза (ОАС), РНКаза L (RNase L) и протеинкиназа R (PKR), чья активность напрямую связана с наличием в клетке дсРНК. Активированная дсРНК ОАС катализирует образование коротких олигоаденилатов, которые при взаимодействии с RNase L переводят ее в активную форму, разрушающую геномную вирусную РНК, препятствуя образованию вирусных белков, что приводит к подавлению репликации вирусов в клетках [10].

Интерфероновая защита реализуется посредством индукции трех различных типов ИФН: ИФН I типа (α, β, ω), ИФН II типа (γ), ИФН III типа (λ). Антивирусная активация развивается не только в клетке, пораженной вирусом, но и в окружающих ее клетках за счет продукции ИФН стимулированной клеткой [11, 12].

Типы ИФН имеют свои отличия и особенности. Так, ИФН-α (семейство из 20 полипептидов, состоящих из 166 аминокислотных остатков) кодируется 24 различными генами, а ИФН-β — одним геном. ИФН-α и ИФН-β взаимодействуют с одним рецептором, CD118, тогда как ИФН-γ (кодирующий ген расположен на 12-й хромосоме) имеет «свой» специфический клеточный рецептор, т. е. отсутствует гомология между геном ИФН-γ и генами ИФН I типа [11, 13].

Доказанная роль ИФН в блокировании инфекционных процессов и присутствие потенциально активных генов ИФН практически во всех клетках человеческого организма обеспечивает возможность «подключения» собственных (индуцированных) ИФН, что и определило новый вектор развития интерферонотерапии [5, 14, 15]. Перечень противовирусных препаратов для применения в медицинской практике значительно расширился с момента внедрения в терапевтические схемы индукторов ИФН (ИИ), действие которых основано на стимуляции выработки собственного (эндогенного) ИФН [4, 5].

В медицинской практике ИИ используют как в монотерапии, так и в комплексном лечении. Одним из вариантов развития линейки ИИ стало создание препаратов — имитаторов вирусных частиц (нуклеиновой кислоты), среди которых наиболее соответствующими требованиям эффективности и безопасности оказались синтетические полинуклеотиды — дсРНК [15–17].

Интерферонотерапия с использованием как ИИ, так и рекомбинантных ИФН позволяет добиваться высокого терапевтического результата, а в комбинации с другими химиотерапевтическими препаратами способствует более быстрой положительной динамике патологического процесса. Например, комбинация ИИ и противовирусных препаратов (синтетические аналоги пуриновых нуклеозидов) обеспечивает потенцированный эффект, что позволило повысить эффективность лечения вирусных заболеваний [15–17].

Фармацевтическая индустрия поставляет на рынок различные варианты ИФН (экзогенных), представляющих собой белковые соединения, которые наряду с терапевтическим воздействием могут вызывать нежелательные явления со стороны различных органов и систем (нервная, сердечно-сосудистая системы, желудочно-кишечный тракт и др.) при парентеральном введении, а при частом введении (особенно в больших дозах) провоцируют выработку антиинтерфероновых антител [5].

Накопленные к настоящему времени данные показывают, что ИИ дсРНК, рибонуклеонат натрия, являясь мультиклональным стимулятором, индуцирует синтез ИФН несколькими клеточными популяциями (клетки мононуклеарно-фагоцитарной системы, гранулоциты, нейтрофилы, клетки эндотелия и фибробласты) и характеризуется высокой активностью (специфической) и безопасностью [15].

Двуспиральная РНК служит активным индуктором ИФН-α (лимфоцитарный) и ИФН-β (фибробластный) и при парентеральном введении индуцирует выработку большого количества ИФН, необходимого для формирования длительной противовирусной защиты организма, а также влияет на альтернативные механизмы функционирования системы иммунитета (клеточного и гуморального) [15, 17, 18].

Эндогенные ИФН, вырабатываемые в ответ на введение ИИ, имеют ряд преимуществ перед экзогенными (рекомбинантными): не стимулируют выработку антител к ИФН; более длительно действуют на организм; оказывают не только терапевтический, но и профилактический эффект; не требуют частого введения, что особенно значимо в контексте фармакоэкономики [19]. Образование эндогенных ИФН регулируется системой цитокинового контроля, который исключает переизбыток ИФН, угнетение синтеза собственных ИФН, возможность повреждающего действия на клетки и ткани организма, что определяет целесообразность применения ИИ в контексте безопасности. Еще одним конкурентным преимуществом ИИ можно считать эффект усиления противовоспалительного потенциала нейтрофильных гранулоцитов за счет усиления генерации ими активных форм кислорода и, как следствие, повышение противовирусных и антибактериальных свойств крови [15, 17, 19–23].

Двуспиральные РНК — индукторы ИФН. Опыт клинического применения

Основным источником чужеродной дсРНК в клетках являются вирусы, при этом двуспиральные формы РНК в естественных условиях представляют собой либо собственно геном вируса, либо возникают в ходе вирусного репродуктивного цикла [24].

Двуспиральные РНК обладают регуляторными функциями в отношении индукции ИФН и ряда других механизмов врожденного иммунитета [25, 26]. Природная дсРНК, выделенная из киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, является ИИ, обладает противовирусными, иммуномодулирующими свойствами. Ответ организма на вирусное вторжение и введение экзогенной дсРНК имеет общие закономерности (узнавание, инициация внутриклеточных сигнальных путей), что и обратило внимание исследователей на двуспиральные полирибонуклеотиды как активные фармацевтические субстанции (АФС) с целью создания эффективных противовирусных препаратов [27, 28].

Двуцепочечные комплексы полирибонуклеотидов Поли(И)-поли(Ц) являются более эффективными ИИ, так как демонстрируют выраженную антивирусную активность по сравнению с поли(А)-поли(Ц) [16].

Природные дсРНК представляют собой репликативные формы РНК, выделенные из фагов и дрожжей [7, 8, 27, 28].

Эффективность и безопасность применения натриевой соли дсРНК в качестве ИИ в медицинской практике подтверждены экспериментальными исследованиями и клиническими наблюдениями.

Так, в экспериментальном исследовании показано, что использование дсРНК вызывает синтез ИФН в сыворотке крови кроликов уже в первые часы после введения («ранняя» продукция ИФН (7000 ИЕ/мл) через 6 ч после введения), позже модулирует активность клеток иммунной системы и влияет на развитие специфического иммунного ответа [17, 29].

В экспериментальном исследовании установлено, что дсРНК, выделенная из дрожжей S. cerevisiae, увеличивает экспрессию TLR3 и активность ИФН-α, ИФН-β, OAС (в макрофагах мышей) в условиях как in vitro, так и in vivo. Максимальный уровень транскрипционной активности перитонеальных макрофагов мышей в первые часы после введения дсРНК в эффективной противовирусной дозе (0,5 мг/кг) был отмечен для генов ИФН-α [7].

В эксперименте на клеточных культурах и в условиях in vivo с использованием разных видов животных и вирусов регистрировали противовирусную устойчивость под действием ИИ (дсРНК) при однократном введении, варьировавшую от 40% до 100% (в зависимости от вирусной модели и объекта исследования) [17].

Раннее включение в процесс выработки собственных ИФН ИИ «раннего типа» (дсРНК) позволяет получить быстрый терапевтический результат, что и было продемонстрировано в клиническом исследовании: у 93% обследованных регистрировали повышение титров ИФН-α в сыворотке крови в течение первых часов до 8–64 ИЕ/0,1 мл сыворотки, что и позволяет отнести дсРНК к ИИ «раннего типа» [17].

В клинике ИИ на основе дсРНК использовали при комплексном лечении больных с ограниченной склеродермией. На фоне положительного лечебного эффекта было установлено стимулирующее влияние на функционирование эндогенного ИФН (увеличение показателя на 99,7%), при этом положительная реакция ингибирования антител отмечалась у 62,1% пациентов, что вдвое выше, чем до лечения [30].

Использование ИИ (дсРНК) для купирования поствакцинальных осложнений после оспопрививания способствовало нормализации биохимических показателей крови на протяжении всего срока наблюдения и характеризовалось практически полным подавлением репродукции вакцинального вируса во внутренних органах [31].

Целесообразность применения ИИ на основе дсРНК с целью повышения терапевтического эффекта и, как следствие, включение в схему лечения герпетических и хламидийных урогенитальных инфекций базируется на данных об эффективности и безопасности, полученных в ходе клинических исследований.

Высокую эффективность ИИ на основе дсРНК наблюдали при лечении 785 больных смешанными урогенитальными инфекциями (сочетание хламидиоза, герпеса и др.). Регресс клинических проявлений наступил у 68,6% пациентов, у 93% регистрировали нормализацию иммунного статуса в целом и показателей ИФН в частности [17]. Было доказано, что применение у больных с хроническим сальпингоофоритом иммуномодулирующей терапии ИИ на основе дсРНК улучшало показатели Т- и В-клеточного звена иммунитета, при этом происходила коррекция фагоцитарного индекса до контрольных значений [32].

В Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии наблюдали 574 женщины и 384 мужчины детородного возраста с урогенитальными инфекциями (69,1% — хламидийная инфекция, 61,1% — вирус простого герпеса), которые получали ИИ (дсРНК) в составе комплексной терапии. Результатом лечения стали увеличение количества Т- и В-лимфоцитов, а также нормализация интерферонового статуса у 93% пациентов [17].

Включение ИИ на основе дсРНК в комплексную терапию беременных женщин, страдающих смешанной генитальной инфекцией — хламидиозом в сочетании с уреа-плазмозом и бактериальным вагинозом, позволило до-биться положительных результатов лечения у 89,4% беременных, что свидетельствует о целесообразности подобного комплексного воздействия [17]. При использовании ИИ (дсРНК) в комплексном лечении 106 пациентов (мужчин), больных урогенитальным хламидиозом (моноинфекции у 64 (60,4%) человек, сочетание с другими урогенитальными инфекциями у 42 (39,9%) человек), этиологическое излечение было достигнуто у 67 (84,8%) пациентов [17].

В Хабаровском кожно-венерологическом диспансере использовали ИИ (дсРНК) при лечении урогенитального герпеса и хламидийной инфекции мочеполовой сферы у мужчин и женщин. Под наблюдением находились 62 пациента с генитальным герпесом (из них 22 супружеские пары), 38 — с хламидийной инфекцией (из них 14 супружеских пар), 21 — с микоплазменной инфекцией (из них 8 супружеских пар). У 14 пациентов (7 супружеских пар) отмечали отсутствие рецидивов в течение 1,5 года после 3 курсов лечения. У больных хламидиозом в 88% наблюдений наступило излечение [17].

Новые технологические решения в производстве препаратов ИИ (дсРНК)

Природные дсРНК — одни из важнейших медиаторов, обеспечивающих индукцию ИФН в ответ на вирусную инфекцию в организме, при этом дсРНК вызывают индукцию всех типов ИФН. Терапевтический потенциал дсРНК является перспективным объектом для создания на их основе противовирусных, антибактериальных, противовоспалительных и противоопухолевых препаратов, а также средств для повышения неспецифической защитной реакции и снижения восприимчивости организма к действию патогенных агентов различной природы [26, 33].

Источниками дсРНК могут являться РНК-содержащие вирусы растений и животных, а также некоторые микромицеты и дрожжи, в частности так называемые киллерные штаммы вида S. cerevisiae [27]. Несмотря на большой интерес к природной дсРНК, описанные способы ее получения недостаточно эффективны и требуют совершенствования.

Сложности в выделении дсРНК из киллерных штаммов S. cerevisiae состоят в разработке такого способа разрушения клеточных стенок дрожжей, который должен быть достаточно эффективным для извлечения максимального количества дсРНК из клетки и при этом достаточно мягким, чтобы сохранить неизменной структуру дсРНК. Другой проблемой, стоящей перед исследователями, является необходимость разработки технологии очистки дсРНК, способной давать продукт с минимальным содержанием примесей (в том числе родственных примесей белка и ДНК), сохраняя высокий выход продукта и не приводя к повышению стоимости препарата.

Известны способы экстракции РНК из клеток дрожжей S. cerevisiae, основанные на кипячении клеточной суспензии в различных водных растворах, в том числе в водных растворах олеата натрия (патент РФ № 2522900), олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью (патент РФ № 2435862, патент РФ № 2510854, патент РФ № 2403288, патент РФ № 2392329), додецилсульфата натрия с добавлением (патент РФ № 2302464) или без добавления (патент РФ № 2430969) литических агентов, а также в водном растворе 2-этилгекрановой кислоты, содержащем 0,1–0,5 М раствор натрия хлорида (патент SU № 936701). Недостатком данных способов является необходимость нагревания суспензии дрожжей до температур, превышающих 70 °С, или кипячения, поскольку в процессе подобного рода термической обработки происходит разрушение водородных связей между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, ответственными за образование двуспиральной структуры РНК и, как следствие, ее денатурация.

Другие способы экстракции РНК из клеток дрожжей, не включающие в себя этапы термической обработки суспензии, например разрушение клеток дрожжей в буфере путем обработки додецилсульфатом натрия в концентрации 1,0% при 20–30 °C и хлороформом в концентрации до 25% при 20–30 °C (патент РФ № 2722731) являются малоэффективными, поскольку для разрушения белково-полисахаридных комплексов и липидов, входящих в состав клеточной стенки дрожжей, использования одних лишь химических агентов недостаточно.

При производстве АФС препарата РАДАМИН^®ВИРО используется запатентованный способ экстракции РНК из клеток киллерного штамма S. cerevisiae (патент РФ № 2781832), основанный на комбинации механического (гомогенизация под давлением 600–1400 бар) и ферментативного (использование фермента зимолитина) способов разрушения клеточных стенок. Состав буферного раствора, в котором суспендируются клетки в процессе гомогенизации, способствует стабилизации структуры РНК и разрушению РНК-белковых комплексов, что позволяет увеличить чистоту и выход продукта.

В РФ зарегистрирован лекарственный препарат РАДАМИН^®ВИРО (дсРНК), при производстве которого применена инновационная запатентованная методика очистки дсРНК (патент РФ № 2781833), включающая в себя в том числе и поэтапное фракционирование в растворах с различными концентрациями хлорида лития, а также несколько этапов депротеинизации, что позволяет добиться высокого качества и безопасности препаратов, минимизируя содержание примесных ДНК и белков. Инновационные технологии позволили улучшить характеристики ИИ, соответствующие высоким требованиям, предъявляемым к данной группе противовирусных препаратов.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что РНК двуспиральной натриевая соль, полученная по новой технологии из киллерных штаммов дрожжей S. cerevisiae, проявляет высокую терапевтическую и профилактическую активность в отношении вирусов (в том числе коронавирусов, включая SARS-CoV-2), что подтверждено экспериментальным исследованием, на основании которого получены патентные решения на изобретения (патент РФ № 2781832 ).

РАДАМИН^®ВИРО, основу которого составляет разработанная по новой методике АФС, являясь ИИ «раннего типа», обладает высокой терапевтической эффективностью и благоприятным профилем безопасности, необходимость которых продиктована современными требованиями в контексте повышения результативности лечения:

стимулирует образование эндогенных ИФН I (ИФН-α, ИФН-β) и ИНФ II (ИФН-γ) типов, которые являются важнейшими цитокинами иммунного ответа;

индуцирует дифференцировку миелоидных клеток;

стимулирует фагоцитоз нейтрофилов и макрофагов;

активирует NK-клетки, усиливает Т-хелперный ответ 1-го типа, таким образом запуская врожденный и адаптивный иммунный ответ;

обеспечивает высокую защиту организма уже на ранних стадиях заражения вирусными или бактериальными инфекциями;

подавляет репродукцию вирусов и различных микроорганизмов (в том числе хламидий) на клеточном уровне;

препятствует развитию инфекционного процесса за счет активации неспецифической резистентности организма;

оптимизирует воспалительные реакции;

обладает выраженным противовоспалительным действием;

опосредованно стимулирует репаративные и регенераторные процессы в организме;

произведен по инновационной технологии (высокая степень очистки).

В терапевтических дозах препарат хорошо переносится, не обладает мутагенным, тератогенным, эмбриотоксическим, канцерогенным действием, сенсибилизирующими, кумулятивными и местно-раздражающими свойствами, что обеспечивает высокий уровень безопасности лекарственного препарата, обусловленный в том числе использованием современных технологий производства. Все вышеперечисленные преимущества и терапевтические свойства позволяют рассматривать РАДАМИН^®ВИРО как перспективный препарат для медицинской практики.

Заключение

Система ИФН выступает первой линией защиты в борьбе с инфекционными агентами преимущественно вирусной природы. Препараты, относящиеся к группе индукторов эндогенного ИФН на основе дсРНК, обладают высоким потенциалом защиты организма человека от вирусов и ряда бактерий за счет активации и нормализации работы собственной иммунной системы. Несомненным их преимуществом можно считать отсутствие рисков, ассоциированных с введением экзогенных ИФН, также используемых в составе интерферонотерапии вирусных инфекций. При этом стремление к повышению эффективности данной группы препаратов при минимизации риска развития нежелательных явлений стимулировало поиск методов обработки сырья, обеспечивающих получение более чистой, а значит, более безопасной АФС, удовлетворяющей всем предъявляемым к ней требованиям. Современные технологии, используемые, например, при производстве АФС препарата РАДАМИН^®ВИРО, позволили получить высокоочищенный биологический продукт, что существенно повышает безопасность препарата и открывает широкие перспективы его использования в клинической практике. 

Сведения об авторах:

Радаева Ольга Александровна — д.м.н., доцент, заведующая кафедрой иммунологии, микробиологии и вирусологии с курсом клинической иммунологии и аллергологии, Медицинский институт ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева»; 430005, Россия, г. Саранск, ул. Большевистская, д. 68; ORCID iD 0000-0003-1383-2474.

Таганов Алексей Викторович — д.м.н., профессор кафедры дерматовенерологии с курсом косметологии факультета непрерывного медицинского образования медицинского института ФГАОУ ВО РУДН; 117198, Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6; медицинский советник ГК «Промомед»; Россия, г. Москва, 129090, пр-т Мира, д. 13, стр. 1; ORCID iD 0000-0001-5056-374X.

Рогожина Екатерина Алексеевна — соискатель кафедры биотехнологии и промышленной фармации РТУ МИРЭА; 119454, Россия, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 78; заместитель начальника отдела по разработкам новых технологий фармакологических субстанций ГК «Промомед»; Россия, г. Москва, 129090, пр-т Мира, д. 13, стр. 1; ORCID iD 0000-0002-3325-2605. Контактная информация: Таганов Алексей Викторович, e-mail: matis87177@yandex.ru.

Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.

Конфликт интересов: А.В. Таганов и Е.А. Рогожина являются сотрудниками ГК «Промомед».

Вклад авторов: Радаева О.А. — разработка концепции статьи, сбор данных литературы; оформление и редактирование рукописи, утверждение окончательного варианта статьи; Таганов А.В., Рогожина Е.А. — перевод иностранных источников литературы, представление актуальной информации о современных разработках в области производства фармацевтических субстанций.

Статья поступила 29.08.2022.

Поступила после рецензирования 21.09.2022.

Принята в печать 14.10.2022.

About the authors:

Olga A. Radaeva — Dr. Sc. (Med.), associate professor, Head of the Department of Immunology, Microbiology and Virology with the course of clinical immunology and allergology, Medical Institute, N.P. Ogarev Mordovia State University; 68. Bol’shevistskaya str., Saransk, 430005, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-1383-2474.

Aleksey V. Taganov — Dr. Sc. (Med.), Professor of the Department of Dermatovenerology with the course of cosmetology, the Faculty of Continuous Medical Education of the Medical Institute, Russian University of Peoples’ Friendship; 6, Miklukho-Maklaya str., Moscow, 117198, Russian Federation; medical advisor of CG Promomed; 13–1, Mira av., Moscow, 129090, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-5056-374X.

Ekaterina A. Rogozhina — external PhD student of the Department of Biotechnology and Industrial Pharmacy, Russian Technological University — Moscow Institute of Radio Engineering, Electronics and Automation (MIREA); 78, Vernadsky av., Moscow, 119454, Russian Federation; Deputy Head of the Department for the Development of Novel Pharmacological Substance Technologies, CG Promomed; 13–1, Mira av., Moscow, 129090, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-3325-2605.

Contact information: Aleksey V. Taganov, e-mail: matis87177@yandex.ru.

Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned.

Conflict of interests: A.V. Taganov and E.A. Rogozhina are employees of CG Promomed.

Contribution of authors: Radaeva O.A. — article concept development and literature data collection; manuscript preparation and editing; final article version approval; Taganov A.V., Rogozhina E.A. — translation of foreign publications, provision of the up-to-date information on the recent advances in pharmaceutical substances production.

Received 29.08.2022.

Revised 21.09.2022.

Accepted 14.10.2022.